Her kan vi rapportere en rask og effektiv gen redigering metode basert på RMCE i AAVS1 locus av humane Pluripotent stamceller (hPSCs) som en forbedring av de tidligere beskrevne systemer. Ved hjelp av denne teknikken, kan isogene linjer være raskt og pålitelig generert for riktig komparative studier, tilrettelegging transgenesis-mediert forskning med hPSCs.
Selv med revolusjonen av gene-målrettingsteknologier ledet av CRISPR-Cas9, genmodifisering av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) er fortsatt tidkrevende. Komparative studier som bruker rekombinante linjer med transgener integrert i trygg havn loci kan ha nytte av tilnærminger som bruker stedsspesifikke målrettede rekombinaser, som Cre eller FLPe, som er raskere og mindre utsatt for off-target effekter. Slike fremgangsmåter er blitt beskrevet, selv om de ikke i vesentlig grad bedre resultater genet målretting i de fleste aspekter. Ved hjelp av sink-finger nukleaser, tidligere opprettet vi en master cellelinje i AAVS1 locus av hPSCs som inneholder en GFP-Hygromycin-tk uttrykke kassett, flankert av heterotypic FRT sekvenser. Her beskriver vi prosedyrene for å utføre FLPe recombinase-mediert kassettbytte (RMCE) ved hjelp av denne linjen. Hoved cell linje er transfektert med et RMCE donor vektor, som inneholder en promoterless Puromycin motstand, og med FLPe rekombinase. Bruk av både en positiv (puromycin) og negative (FIAU) utvalg programmet fører til valg av RMCE uten tilfeldige integrasjoner. RMCE genererer fullt karakteriserte pluripotente polyklonale transgene linjer i 15 d med 100% effektivitet. Til tross for den nylig beskrevet begrensningene i AAVS1 locus, den enkle systemet åpner for hPSC transgenesis i isogene innstillinger, er nødvendig for komparative studier, og muliggjør semi-high-throughput genetiske skjermer for gevinst / tap av funksjonsanalyse som ellers ville være meget tidkrevende.
Målrettet genom rekombinasjon har tilrettelagt raske fremskritt i mange områder av forskning. I mus, har den synergien mellom genomet redigering og stamcelle forskning tillatt for en økt forståelse av den komplekse mekanismen av genfunksjon og genregulering. En slik fremgang er forventet i humane pluripotente stamceller (hPSCs) også, men for mange år siden den første isolering av humane embryonale stamceller (hESCs), og senere menneskeskapte Pluripotent stamceller (hiPSCs), genet redigering har utgjort en teknisk hinder . Nylige fremskritt i genomet teknikk ved hjelp av målrettede nukleaser-Sink Finger nukleaser (ZFNs), transkripsjon aktivator lignende effektor nukleaser (Talen), eller Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic repetisjoner / CRISPR-assosiert protein 9 (CRISPR / Cas9) har tillatt oss å overvinne disse vanskeligheter, noe som gjør målrettet rekombinasjon en effektiv prosess 1-3.
Spesifikk loci i mOuse genomet som tillater stabil, pålitelig, og allestedsnærværende transgene uttrykk i fravær av skadelige effekter som Rosa26, Hprt1, eller Col1A1, har blitt viktige verktøy i utførelsen av genetiske studier. Safe Harbor loci tillate sammenlignbar analyse mellom ulike linjer av mus i isogene sammenhenger. Dette kan ikke oppnås ved bruk av standard tilfeldig integrasjonsmetoder, som er forbundet med kjente begrensninger som insertional mutagenese, doseavhengige effekter, eller spraglete transgene uttrykk. Gene redigering letthet og fleksibilitet i trygg havn loci økes gjennom bruk av stedsspesifikke målrettede rekombinaser som Cre eller Flippase (FLPe), som spesifikt gjenkjenner målsekvenser (loxP eller FRT, henholdsvis) og katalyserer effektiv rekombinasjon mellom identiske mål. På grunn av disse egenskaper, rekombinase-formidlet gen redigering ved hjelp av loxP eller FRT-sekvenser i preintegrated trygg havn loci er et vanlig verktøy som brukes i mus transgenesis. I tillegg til kassett innsetting eller fjerning mediert mellom identiske mål sekvenser, bruk av inkompatible loxP eller FRT nettsider tillater recombinase-mediert kassettbytte (RMCE) 4.
I human har forsøk på å identifisere sikre havne loci er blitt utført. Musen ortologe HPRT, til tross for sin tilknytning til tap-av-funksjon Lesch-Nyhan syndrom, og ROSA26 har vært målrettet i hPSCs. HPRT ble rapportert å raskt slå transgene uttrykk i ESC, og som ROSA26, dens evne til å opprettholde transgene uttrykk i terminalt differensierte celler ikke ble undersøkt 5-7. Fordi en homozygot null mutasjon av CCR5-genet ser ut til å være godt tolerert hos mennesker, ble dens verdi som trygg havn vurderes. CCR5 var målrettet og rapportert til å opprettholde stabile transgene uttrykk i ulike humane cellelinjer, inkludert ESCs 8,9. Derimot,sistnevnte ble ikke påvist i den klonale nivå ved langtidskultur, og allestedsnærværende transgen ekspresjon ble ikke påvist i differensiert avkom av de tre bakterie lag. AAVS1, den naturlige integreringssete av den Adeno Associated Virus type 2 (AAV), ble testet i hESCs også, på grunn av rapporterte motstand mot transgenet stanse 10. Senere mange grupper brukte AAVS1 locus og beskrevet stabil transgen ekspresjon i udifferensierte hPSCs, så vel som i deres differensiert avkom av alle tre bakterie lag, både in vitro og in vivo 2,8,11,12. De siste resultatene likevel nyansere disse funnene, som AAVS1 locus ble funnet å utøve variable transgenet hemming in vitro i udifferensierte hESCs og i hepatocytter avkom 13.
Andre screening studier med tilfeldige integrasjon tilnærminger og metoder for å bestemme ett eksemplar integrering forsøkte å finne genomic integrasjonssider resistente mot transgenet stanse under hPSCs ekspansjon og differensiering 14,15. Samlet sett til nå, ingen genomisk Nettstedet er fullt godkjent som en trygg havn i hPSCs og deres avkom; identifikasjon av en passende område for allestedsnærværende stabil transgen ekspresjon, ikke bare i hPSCs men også i sine differensierte progenies in vitro og in vivo, gjenstår å bli løst. Blant alle de undersøkte loci og til tross for sine begrensninger, forblir AAVS1 best-preget og mest brukte i stamcelleforskning.
RMCE har blitt utført i hPSCs i noen av disse loci 6,7,14,16, hovedsakelig ved hjelp av Cre rekombinase, selv om mye tyder på at FLPe er mer effektiv enn Cre 17. I alle disse tilfellene ble en positiv medikamentresistens kassetten anvendt for seleksjon av rekombinante kolonier. Selv vellykket, disse prosedyrene ikke utgjør en teknisk fremskritt i forhold til standard gen-redigering prosedyrer ved hjelp ZFNs, Talens eller CRISPR / Cas9, som en enkelt antibiotika utvelgelsesprosedyre utelukker ikke tilfeldige integrasjoner og krever koloni screening for å identifisere riktig målrettede kloner.
I denne prosedyren, beskriver vi metoder for å utføre RMCE i hPSCs i AAVS1 locus ved hjelp av en kombinasjon av positiv (innenfor innkommende kassett) og negative (innenfor preintegrated kassett) valg som gir mulighet for generering av polyklonale transgene linjer i ± 15 dager med 100% effektivitet og kostnads tilfeldige integrering hendelser. Derfor representerer denne metoden fremgang utover tiden beskrevet RMCE teknologier i hPSCs.
Gene redigering metoder i safe harbour loci forbli et viktig verktøy for å utvikle transgenesis i hPSCs. Selv om den trygge havnen karakter AAVS1 har nylig blitt avhørt for enkelte programmer 13,18, forblir dette locus for tiden det beste kjennetegnet ved humane cellelinjer utvunnet. Bevissthet om sine begrensninger i hPSCs kan bidra til å få pålitelige data. Derfor er AAVS1 fortsatt forventes å være et nyttig nettsted, for eksempel for gevinst-og tap-av-funksjon studier eller induserbar / konstituerende uttrykk for faktorer som krever en isogen sammenheng i og mellom bestemte genetiske bakgrunn.
Den AAVS1 locus har blitt angrepet av mange grupper som bruker ZFNs, TALEN eller CRISPR / Cas9 1,2,19. Disse nukleaser i betydelig grad øke effektiviteten av homolog rekombinasjon i en bestemt locus. Imidlertid er prosessen skjermen og fullstendig karakterisering korrekt rettet kloner, fri for tilfeldig integrasjon og å opprettholde pluripotency og genom integritet kan ta opptil 3 måneder (med optimaliserte genet redigeringsverktøy) (figur 3). De to sistnevnte kan være forårsaket av mulige mutasjoner som genereres av off-target nukleaseaktivitet. Den RMCE system som brukes her, men tilbyr en rask, effektiv og elegant metode for å oppnå dette målet i bare to uker, når rekombinase spesifikke mål sekvenser preintegrated inn i AAVS1 locus. Bruk av positiv / negativ seleksjon og et passende utvalg program er de viktigste faktorene som bidrar til forenkling av genet redigering i AAVS1 locus av RMCE.
Genotypisk karakterisering av de nye transgene linjer er betydelig redusert (ikke klonal screening er nødvendig), og karakterisering forbundet til off-target nukleaseaktivitet er gjengitt unnværlig på grunn av spesifisiteten av FLPe for FRTs. Karakteriseringen kan også reduseres i rutine RMCE eksperimenter ved å demonstrerefullstendig tap av GFP uttrykk fra master-cellelinjen (figur 2A), fordi fullstendig kassett utveksling og mangel på tilfeldig integrering er allerede tilstrekkelig måte ved hjelp av PCR (figur 2B), og Southern blot-13. Bruk av positiv / negativ seleksjon utgjør også den største forskjellen med tidligere rapporter. Flere grupper som tidligere er beskrevet RMCE i hPSCs, enten i AAVS1 eller andre loci, anvendes kun en enkelt positiv seleksjonstrinnet 7,14,16. Dette utgjør ikke et vesentlig teknisk fordel overfor gen redigering utført med nukleaser, fordi koloniscreening må være likt utført for å demonstrere riktig integrering og fravær av tilfeldig integrering på den klonale nivå.
Bruk av dette system RMCE i flere hESC / IPSC linjer krever preintegration av den beskrevne FRT-inneholdende kassett i AAVS1 locus av hver uavhengig linje. Imidlertid, når generert,sin hurtighet og enkelhet gjør det mulig å utvikle semi-high throughput genetiske skjermer i definerte isogene innstillingene for programmene som er nevnt ovenfor som ellers ville være teknisk svært tidkrevende. I tillegg er alle RMCE vektorer konstruert innenfor PZ AAVS1 genet målretting vektor brukt til å målrette locus med ZFNs, men Talens eller CRISPR / Cas9 ble også rapportert. Den RMCE vektor sin dualitet er svært nyttig å generere flere linjer for en bestemt transgen i hPSCs med eller uten FRT. For eksempel, en hit demonstrert vellykket i en bestemt genetisk skjerm utføres av RMCE ville ideelt trenger å bli testet i flere hPSC linjer for å bekrefte resultatene. I fravær av multiple RMCE-passende mester cellelinjer, kan direkte genet målretting av trykk ved hjelp av nukleaser utføres. Nytten av den doble karakter av RMCE vektorer har blitt bevist av vår gruppe 20. I denne studien ble genet korreksjon utført i pasient-avledetFrontotemporal demens (FTD) iPSCs som bærer en mutasjon som forårsaker PROGRANULIN (PGRN) uttrykk mangel. Gene komplementering av ZFNs-mediert innføring i AAVS1 locus av en kassett som restaurert PGRN nivåer, korrigeres den defekte fenotypen i corticogenesis assosiert med tilstedeværelse av mutasjonen. I tillegg ble en tilsvarende linje som genereres ved RMCE i WT hESCs å bli brukt som kontroll for eksogen PGRN ekspresjon.
I fravær av rekombinante kolonier, kontrollerer transfeksjonseffektiviteten av RMCE donor-vektoren. Transfeksjonseffektiviteter overlegne i forhold til 30% gi de resultater som er angitt ovenfor. Lavere transfeksjonseffektiviteter redusere rekombinasjon effektivitet. Endelig har RMCE system blitt generert i den AAVS1 locus, men det kan anvendes for en hvilken som helst annen locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |