这里,我们报告在先前所描述的系统,提高了在人多能干细胞(hPSCs)的AAVS1轨迹基于RMCE迅速和有效的基因编辑方法。使用这种技术,基因系可迅速而可靠地进行适当的比较研究产生,促进与hPSCs转基因介导的研究。
即使通过CRISPR-Cas9,人类多能干细胞(hPSCs)的遗传修饰导致基因靶向技术的革命仍然是费时。比较研究使用重组线,融入避风港转基因位点可从使用特定网站定位的重组酶,如Cre重组酶或FLPE的方法,这是更快速,更不容易脱靶效应中受益。这样的方法已被描述,但它们不显著跑赢基因在大多数方面定位。用锌指核酸酶,我们先前创建在包含GFP-潮霉素-TK表达盒hPSCs的AAVS1轨迹的主细胞系,通过异型FRT序列侧翼。在这里,我们将介绍使用此行来执行FLPE重组酶介导的盒式交换(RMCE)的程序。主ÇELL线转染用RMCE供体载体,其含有一个启动子嘌呤霉素抗性,并与FLPE重组酶。两个正(嘌呤霉素)和负极(FIAU)的选择方案的应用导致RMCE的选择而不随机整合。 RMCE在15天与100%的效率产生完全多能性特征多克隆转基因株系。尽管最近描述了AAVS1轨迹的限制,便于系统铺平了道路,在同基因设置HPSC转基因的方式,是必要的对比研究,并支持半高通量遗传筛选进行功能分析的收益/损失否则会是非常费时。
有针对性的基因重组在研究许多领域促进了快速发展。在小鼠中,基因组编辑和干细胞研究之间的协同作用已经允许基因功能和基因调控的复杂机制的增加了解。这样的进步,预计在人多能干细胞(hPSCs)为好,虽然多年以来人类胚胎干细胞的所述第一隔离(胚胎干细胞),和诱导后人多能干细胞(人iPS细胞),基因的编辑已构成一个技术障碍。通过有针对性的核酸,锌指核酸酶(ZFNs),转录激活因子样效应核酸酶(TALEN),或基因组工程的最新进展集群定期相互间隔短回文重复/ CRISPR相关蛋白9(CRISPR / Cas9)使我们能够克服这些困难,使得定向重组的有效方法1 – 3。
在M特异位点乌斯基因组,允许在没有像ROSA26,HPRT1,或COL1A1不良影响稳定的,可靠的,和无处不在的转基因表达,遗传研究的性能已经成为必不可少的工具。安全港座位允许等基因背景不同线路的小鼠之间的可比性分析。这不能用标准的随机整合的方法,这是与像插入突变,剂量依赖性的效果,或杂色转基因表达公知的限制相关联来实现。基因编辑易用性和灵活性,安全港位点是通过使用位点特异性重组酶的目标像酶Cre或翻转酶(FLPE),其特异性识别靶序列(loxP序列或FRT,分别)和催化相同的目标之间的高效重组增加。由于这些特性,使用的loxP或FRT序列中预先集成安全港位点的重组酶介导的基因编辑是在小鼠反式使用的常用工具成因。除了磁带盒插入或相同的靶序列之间介导切除,利用不相容的loxP或FRT位点允许重组酶介导的盒式交换(RMCE)4。
在人类,试图找出避风港位点已经进行了。鼠标直系HPRT,尽管它与失功能莱-尼综合征,和ROSA26协会已定位在hPSCs。HPRT报道迅速沉默ESC转基因表达,像ROSA26,其维持在转基因表达的能力终末分化细胞未研究5 – 7。由于CCR5基因的纯合无效突变似乎在人体耐受性良好,其作为避风港的价值进行了评估。CCR5是针对并上报维持在不同的人类细胞系,包括胚胎干细胞8,9稳定的转基因表达。然而,后者未在长期培养过程中的克隆水平证明,和无处不在的转基因表达中未三个胚层的分化后代证实。AAVS1中,腺相关病毒2型(AAV)的自然整合位点,进行了测试在人类胚胎干细胞为好,因为报道抵抗转基因沉默10。后来,许多团体使用的AAVS1轨迹和描述于未分化hPSCs稳定的转基因表达,以及在其所有三个胚层的分化后代,无论是在体外和体内 2,8,11,12。最近的结果仍然细微差别这些发现,为AAVS1基因被发现施加体外可变转基因抑制未分化的胚胎干细胞和肝细胞的后代13。
使用随机整合的途径和方法附加筛选研究,以确定单拷贝整合的目的是找到格诺期间hPSCs扩增和分化14,15到转基因沉默耐麦克风整合位点。总体来说,到现在为止,没有任何基因组位点已被完全验证为hPSCs及其后代一个安全的港湾;普适稳定的转基因表达,不仅在hPSCs而且在体外和体内的分化后代的适当位置的确定,仍有待解决。在所有的研究基因座,尽管它的局限性,AAVS1仍然是最好的,其特征在于与在干细胞研究最使用。
RMCE已hPSCs在一些这些位点6,7,14,16的顺利进行,主要使用Cre重组酶,即使有迹象表明FLPE比的Cre 17更有效。在所有这些情况下,被用于重组菌落的选择一个正药物抗性盒。虽然成功的,这些程序并不构成了标准的基因 – 技术进步采用的ZFNs编辑程序,TALENS或CRISPR / Cas9,作为一个单一的抗生素筛选过程,不排除随机整合,并要求克隆筛选,以确定正确的目标克隆。
在此过程中,我们描述的方法来在hPSCs在AAVS1轨迹使用(在预集成的磁带盒内)的阳性结合(传入盒内)和阴性选择,其允许的多克隆转基因系的产生在±15天用执行RMCE 100%的效率和免费随机整合事件。因此,这种方法代表了超出hPSCs目前描述RMCE技术进步。
在安全港的基因位点的编辑方法有待开发转基因在hPSCs一个必不可少的工具。虽然AAVS1的安全港角色,最近被质疑对某些应用13,18,该位点目前仍然是最好的特征来源于人的细胞系。它在hPSCs局限性的认识可以帮助获取可靠的数据。因此,AAVS1仍有望成为有用的站点,例如,对于GAIN-功能失和研究或要求内和确定的遗传背景之间的等基因上下文因子诱导/组成型表达。
该AAVS1轨迹已通过使用的ZFN,TALEN或CRISPR / Cas9 1,2,19许多组的目标。这些核酸显著增加同源重组的效率在一个确定的轨迹。然而,这一进程筛选并充分体现正确靶克隆,随意自由的INTEG配给并保持多能性和基因组的完整性可能需要长达3个月(使用优化的基因编辑工具)( 图3)。最后两个可以通过脱靶核酸酶活性产生的可能突变而引起。这里使用的RMCE系统,但是,提供了一个快速,高效,优雅的方式来实现这一目标只有两个星期,一旦特异性重组酶靶序列被预先集成到AAVS1轨迹。正/负选择和适当的选择程序的使用是造成基因编辑由RMCE的AAVS1轨迹简化的主要因素。
新转基因系的基因型表征显著减少(没有克隆筛选是必要的),以及相关联的脱靶核酸酶活表征由于FLPE为FRTS特异性呈现可有可无。表征也可以在常规RMCE实验通过展示减少从主细胞系( 图2A)GFP表达的完全丧失,因为充分的盒式交换和缺乏随机整合的已被充分利用PCR( 图2B)显示出与Southern印迹13。使用正/负的选择也构成与以前的报告的主要区别。先前在hPSCs描述RMCE,无论是在AAVS1或其他基因座若干组,仅采用单一的阳性选择步骤7,14,16。这并不构成在与核酸进行基因编辑的一大技术优点,因为克隆筛选具有以证明在克隆水平正确整合和不存在随机整合的可同样进行。
在多个人类胚胎干细胞/ iPSC系本RMCE系统的使用需要在每个独立的线路的AAVS1轨迹所描述的含有FRT-盒的preintegration。然而,一旦产生,其快速性和简单性使得有可能开发否则上面提到的应用中定义的等基因设置半高通量遗传筛选将是技术上非常费时。此外,所有的RMCE载体用于靶向与的ZFN轨迹的PZ AAVS1基因靶向载体内构造,但TALENS或CRISPR / Cas9也报告。该RMCE向量的对偶是产生多行中具有或不具有FRT hPSCs确定的转基因是非常有用的。例如,一击证明成功地由RMCE进行了确定的遗传筛选将理想需要在多个HPSC线进行测试,以证实结果。在没有多RMCE,适合主细胞系时,可以进行直接利用基因核酸命中定位。在RMCE载体的双重特性的工具,得到了广大组20证实。在这项研究中,基因修正在源自患者的进行额颞叶痴呆(FTD)而承受引起PROGRANULIN(PGRN)的表达缺失的突变iPS细胞。通过在还原PGRN水平盒的AAVS1轨迹的ZFN介导的插入基因互补,校正与所述突变的存在相关联corticogenesis缺陷表型。此外,通过在WT的hESC RMCE产生的可比线被用作外源PGRN表达的控制。
在没有重组菌落,检查RMCE供体载体转染效率。优于30%的转染效率,得到上述结果。较低的转染效率降低重组效率。最后,已在AAVS1轨迹生成的RMCE系统,但它也适用于任何其它轨迹。
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |