כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.
אפילו עם המהפכה של טכנולוגיות מיקוד-גן בראשות CRISPR-Cas9, ושינוי גנטי בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) עדיין זמן רב. מחקרים השוואתיים המשתמשים קווי רקומביננטי עם transgenes משולב לוקוסי נמל מבטחים יכולים להפיק תועלת גישות המשתמשות recombinases במיקוד ספציפי באתר, כמו Cre או FLPe, שהן יותר מהירים ופחות נוטות השפעות חוץ-יעד. כזה שיטות תוארו, למרות שהם לא להכות גן משמעותי מיקוד ברוב ההיבטים. שימוש nucleases אבץ-אצבע, יצרנו בעבר שורת תאים שני לוקוס AAVS1 של hPSCs המכיל GFP-hygromycin-tk להביע קלטת, מוקף רצפים FRT heterotypic. כאן אנו מתארים את ההליכים לבצע חילופי קלטת FLPe בתיווך recombinase (RMCE) באמצעות קו זה. ג אבell הקו טרנספקציה עם וקטור התורם RMCE, המכיל התנגדות puromycin promoterless, ועם FLPe recombinase. יישום של השנייה חיובי (puromycin) ושלילי תכנית הבחירה (FIAU) מוביל את הבחירה של RMCE ללא ואינטגרציות אקראיות. RMCE יוצרת קווי מהונדס polyclonal פלוריפוטנטיים מאופיינים במלואו ב -15 ד עם יעילות 100%. למרות שתואר מגבלות לאחרונה של מוקד AAVS1, הקלות של מערכת סוללת את הדרך עבור transgenesis hPSC במסגרות isogenic, הכרחי במחקרים השוואתיים, ומאפשרת למחצה תפוקה גבוהה מסכי גנטי רווח / הפסד של ניתוח פונקציה שאחרת להיות זמן רב מאוד.
רקומבינציה הגנום הממוקדת יש להקל התקדמות מהירה בתחומים רבים של מחקר. בעכברים, הסינרגיה בין עריכת הגנום מחקר בתאי הגזע אפשרה הבנה מוגברת של המנגנון המורכב של תפקוד גן ואת ויסות גנים. התקדמות כזו צפויה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) וכן, אף ששנים רבות מאז הבידוד הראשון של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), ואנושי מאוחר מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs), עריכת הגן היוותה משוכה טכנית . התפתחויות אחרונות בהנדסת הגנום באמצעות nucleases-אבץ ממוקד nucleases אצבע (ZFNs), nucleases מפעיל דמוי מפעיל תמלול (Talen), או באשכולות interspaced בקביעות קצר חוזר palindromic / קשור-CRISPR חלבון 9 (CRISPR / Cas9) אפשרו לנו להתגבר אלה קשיים, מה שהופך ממוקד רקומבינציה תהליך יעיל 1 – 3.
לוקוסים ספציפיים מעל יד הבית הגנום המאפשרים ביטוי transgene יציב, אמין, ואת בכל מקום בהעדר תופעות לוואי כמו Rosa26, Hprt1, או Col1A1, הפכו כלים חיוניים בביצוע מחקרים גנטיים. לוקוסים נמל מבטחים לאפשר ניתוח השוואה בין קווים שונים של עכברים בהקשרים isogenic. זה לא יכול להיות מושג באמצעות שיטות אינטגרציה אקראית סטנדרטיות, אשר משויכות מגבלות ידועות כמו mutagenesis insertional, תופעות תלויות במינון, או ביטוי transgene ססגוני. ג'ין בקלות עריכת וגמישות לוקוסים נמל מבטחים הוא גדל באמצעות recombinases במיקוד ספציפי באתר כמו Cre או Flippase (FLPe), אשר במיוחד לזהות רצפי היעד (loxP או FRT, בהתאמה) ו לזרז רקומבינציה יעיל בין מטרות זהות. בשל תכונותיו אלה, עריכת הגן בתיווך recombinase באמצעות רצפי loxP או FRT ב לוקוסים נמל מבטחים preintegrated הוא כלי נפוץ בשימוש בעכבר טרנסבראשית. בנוסף כניסת קלטת או כריתה בתיווך בין רצפי יעד זהים, השימוש באתרי loxP או FRT בקנה מאפשר חילופי קלטת בתיווך recombinase (RMCE) 4.
ב אדם, מנסה לזהות לוקוסים נמל מבטחים בוצעו. העכבר HPRT orthologous, למרות הקשר שלה עם הפסד של פונקציה לש-Nyhan תסמונת, ו ROSA26 כבר ממוקד hPSCs. HPRT נמסר להשתיק במהירות ביטוי transgene ב ESC, וכמו ROSA26, יכולתה לקיים ביטוי transgene ב תאים מובחנים סופני לא נחקר 5 – 7. בגלל מוטצית null הומוזיגוטים של גן CCR5 נראה נסבלת היטב בבני אדם, ערך כפי נמל מבטחים הוערך. CCR5 היה ממוקד ודיווח לקיים ביטוי transgene יציב שורות תאים אנושיות שונות, כולל ESCs 8,9. למרות זאת,האחרון לא היה מוכח ברמה המשובטת במהלך לתרבות לטווח ארוכה, וביטוי transgene בכל המקום לא הודגם צאצאי בדיל של השלוש השכבות הניבטות. AAVS1, אתר האינטגרציה הטבעי של 2 סוג נגיף Adeno Associated (AAV), נבדק כמו גם ב hESCs, בגלל התנגדות דיווח transgene השתקה 10. מאוחר יותר, קבוצות רבות השתמשו מוקד AAVS1 ותארו ביטוי transgene יציב hPSCs המובחן, כמו גם צאצאי הבדיל שלהם של כל השלוש השכבות הניבטות, היא במבחנת in vivo 2,8,11,12. התוצאות האחרונות בכל זאת Nuance ממצאים אלה, כמו מוקד AAVS1 נמצא להפעיל עיכוב transgene משתנה במבחנה hESCs המובחן וב hepatocyte צאצאי 13.
מחקרי הקרנה נוספים באמצעות גישות אינטגרציה אקראיות ושיטות לקבוע אינטגרצית עותק יחידה בקשה חוקרים לדעת GENOשילוב מיקרופון אתרים עמידים השתקת transgene במהלך התרחבות hPSCs והבחנת 14,15. בסך הכל, עד עכשיו, אף אתר גנומי יאומת מלא כנמל מבטחים hPSCs וצאצאיהם; זיהוי האתר מתאים ביטוי transgene יציב בכל מקום, לא רק hPSCs אלא גם progenies הבדיל שלהם במבחנה ובחי, עדיין פתרון. בין כל הלוקוסים למדו ולמרות מגבלותיה, AAVS1 נשאר מאופיין ביותר ורוב-המשמש למחקר בתאי גזע.
RMCE בוצע בהצלחה hPSCs בכמה לוקוסים אלה 6,7,14,16, בעיקר באמצעות Cre recombinase, גם אם יש אינדיקציות לכך FLPe היא יעילה יותר מאשר Cre 17. בכל המקרים הללו, עמידות לתרופות חיובית אחד קלטת שמשה לבחירת מושבות רקומביננטי. למרות מוצלח, נהלים אלה אינם מהווים מראש טכניים על gene- תקןנהלי עריכה באמצעות ZFNs, TALENs או CRISPR / Cas9, כהליך מבחר האנטיביוטיים יחידים אינו פוסלים ואינטגרציות אקראיות ודורשים הקרנת מושבה לזהות שיבוטים ממוקדים כראוי.
בהליך זה, אנו מתארים שיטות לבצע RMCE ב hPSCs שעברו על מקורות AAVS1 באמצעות שילוב של חיובי (בתוך הקלטת הנכנסת) ושלילי (בתוך קלטת preintegrated) בחירות המאפשרות עבור הדור של קווי מהונדס polyclonal ב ± 15 ימים עם יעיל 100% ונטולים אירועי אינטגרציה אקראיים. לכן, שיטה זו מייצגת התקדמות מעבר תיאר כרגע טכנולוגיות RMCE ב hPSCs.
ג'ין שיטות העריכה ב לוקוסים נמל מבטחים להישאר כלי הכרחי כדי לפתח transgenesis ב hPSCs. למרות שדמות Safe Harbor, AAVS1 נחקרה לאחרונה עבור יישומים מסוימים 13,18, מוקד זה כרגע נשאר הטוב ביותר מאופיין בקווי תא נגזרות אנושיים. מודעות מגבלותיה ב hPSCs יכול לעזור לקבל נתונים מהימנים. לכן, AAVS1 עדיין צפוי להיות אתר שימושי, למשל, ללימודי gain- והפסד של פונקציה או מושרה / ביטוי המכונן של גורמים המחייבים בהקשר isogenic בתוך ובין רקע גנטי נחושה.
מוקד AAVS1 היוותה מטרה קבוצות רבות באמצעות ZFNs, Talen או CRISPR / Cas9 1,2,19. nucleases אלה להגדיל באופן משמעותי את היעילות של רקומבינציה הומולוגי מוקד נחוש. עם זאת, התהליך של הבדיקה באופן מלא לאפיין שיבוטים ממוקדים כראוי, ללא integ האקראימנה ולשמור pluripotency הגנום שלמות יכול להימשך עד 3 חודשים (בעזרת כלי עריכת גן מותאמים) (איור 3). שני האחרונים יכולים להיגרם על ידי מוטציות אפשריות שנוצרו על ידי פעילות nuclease מחוץ היעד. מערכת RMCE משמשת כאן, לעומת זאת, מציעה שיטה מהירה, יעילה, ואלגנטית להשיג מטרה זו רק שבועות, פעם רצפי יעד recombinase-ספציפי preintegrated לתוך מוקד AAVS1. שימוש סלקציה חיובית / שלילית תכנית בחירה מתאימה הם הגורמים המרכזיים שתרמו לפישוט עריכת גני לוקוס AAVS1 ידי RMCE.
אפיון Genotypic של קווי המהונדס החדשים מצטמצם משמעותי (לא הקרנה משובטת יש צורך), ואפיון הקשורים לפעילות nuclease מחוץ היעד מוצג לוותר בשל הספציפי של FLPe עבור FRTs. האפיון ניתן להפחית גם בניסויים RMCE שגרתית על ידי הוכחתאובדן מוחלט של ביטוי ה- GFP מקו תא אב (איור 2 א), כי חילוף קלטת מלאה וחוסר האינטגרציה אקראית כבר הוכחו באופן מספק על ידי PCR (תרשים 2B) ו כתם דרום 13. שימוש סלקציה חיובית / שלילית גם מהווה את ההבדל העיקרי עם דיווחים קודמים. כמה קבוצות כי שתואר לעיל RMCE ב hPSCs, בין אם AAVS1 או לוקוסים אחרים, מועסקים רק צעד סלקציה חיובית אחת 7,14,16. זה אינו מהווה יתרון טכני עיקרי על עריכת הגן בצעה עם nucleases, כי הקרנת מושבה צריכה להתבצע באופן שווה על מנת להפגין שילוב והיעדרות נכונים של שילוב אקראי ברמה המשובטת.
שימוש במערכת RMCE זה מספר שורות hESC / iPSC דורש preintegration של הקלטת FRT המכיל המתואר מוקד AAVS1 של כל קו עצמאי. עם זאת, ברגע שנוצר,המהירות והפשטות שלה מאפשרים לפתח מסכי תפוקה גנטיים למחצה גבוהה במסגרות isogenic מוגדרת עבור יישומים שהוזכרו לעיל כי אחר יהיה מאוד זמן רב טכני. בנוסף, כל הווקטורים RMCE בנויים בתוך וקטור מיקוד הגן PZ AAVS1 משמשים למיקוד לוקוס עם ZFNs, אבל TALENs או CRISPR / Cas9 דווחו גם. הדואליות של וקטור RMCE שימושית מאוד כדי ליצור קווים מרובים עבור transgene נחושה hPSCs עם או בלי FRT. לדוגמה, אחד פגע הפגינו מוצלח מסך גנטי נחוש שביצעו RMCE יזדקק באופן אידיאלי להיבדק בקווים hPSC מרובים כדי לאשר את התוצאות. בהעדר שורות תאי מאסטר המרובים RMCE-מתאים, גן ישיר מיקוד של הלהיט באמצעות nucleases יכול להתבצע. השירות של הדמות הכפולה של וקטורי RMCE הוכח על ידי הקבוצה שלנו 20. במחקר זה, תיקון גן בוצע נגזרות חולותדמנציה פרונטו-טמפורלית (FTD) iPSCs הנושאות מוטציה גורמת PROGRANULIN (PGRN) חסר הבעה. שלמת ג'ין ידי החדרה בתיווך ZFNs שעברו על מקורות AAVS1 של קלטת כי משוחזר רמות PGRN, תקנה את הפנוטיפ הפגום corticogenesis הקשורים בנוכחות המוטציה. בנוסף, קו דומה נוצר על ידי RMCE ב hESCs WT לשמש מלאה לביטוי PGRN אקסוגניים.
בהעדר מושבות רקומביננטי, לבדוק יעילות transfection של וקטור התורם RMCE. יעילות transfection מעולה עד 30% מניבות את התוצאות המצוינות לעיל. יעילות transfection תחתונה להקטין יעילות רקומבינציה. לבסוף, מערכת RMCE נוצרה ב לוקוס AAVS1, אבל זה חל על כל מוקד אחר.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |