ここでは、以前に記載されたシステムを改良するヒト多能性幹細胞(hPSCs)のAAVS1座にRMCEに基づいて、迅速かつ効率的な遺伝子編集方法を報告しています。この技術を用いて、同質遺伝子系統を迅速かつ確実にhPSCsで形質転換媒介性の研究を容易に、適切な比較試験のために生成することができます。
でもCRISPR-Cas9率いる遺伝子ターゲッティング技術の革命で、ヒト多能性幹細胞(hPSCs)の遺伝的改変は、まだ時間がかかります。セーフハーバーの遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子を有する組換え回線を使用する比較研究は、より迅速かつオフターゲット効果を受けにくくしているのCreまたはFLPeなどの部位特異的な標的にリコンビナーゼを、使用するアプローチから利益を得ることができます。彼らはほとんどの側面にターゲッティング大幅にアウトパフォーム遺伝子をしませんが、このような方法は、記載されています。ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、我々は以前に異FRT配列に挟まれたGFP-ハイグロマイシン-TKを発現カセットを含むhPSCsのAAVS1遺伝子座におけるマスターセルラインを、作成しました。ここでは、このラインを使用してFLPeリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を実行する手順について説明します。マスタCエルラインは、プロモーターピューロマイシン耐性を含み、FLPeリコンビナーゼとRMCEドナーベクター、トランスフェクトされます。両方(ピューロマイシン)正と負(FIAU)選択プログラムの適用はランダム統合することなく、RMCEの選択につながります。 RMCEは、100%の効率で15(d)に完全に特徴付けられた多能性ポリクローナルトランスジェニック系統を生成します。関わらず、最近AAVS1遺伝子座の限界を説明し、システムの使いやすさは、同質遺伝子設定でHPSCの遺伝子導入のための道を開く比較研究のために必要であり、そうでなければそのあろう機能解析のゲイン/損失のためのセミハイスループット遺伝子スクリーニングを可能にします非常に時間がかかること。
ターゲットを絞ったゲノム組換えは、研究の多くの分野の急速な進歩を促進してきました。マウスでは、ゲノムの編集や幹細胞研究の相乗効果は、遺伝子機能および遺伝子調節の複雑な機構の増加理解を可能にしました。ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)の第1の分離、およびそれ以降の人間の人工多能性幹細胞(hiPSCs)以来、長年にわたり、遺伝子編集は、技術的なハードルを構成しているが、このような進歩は、同様にヒト多能性幹細胞(hPSCs)に期待されています。対象となるヌクレアーゼ – ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNを)、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9(CRISPR / Cas9)を使用して、ゲノム工学における最近の進歩は、私たちはこれらを克服することができました3 –標的組換え効率的なプロセス1を作る難しさ、。
メートル内の特定の遺伝子座Rosa26、HPRT1、またはCOL1A1のような副作用の不在下で、安定した信頼性の高い、ユビキタス導入遺伝子の発現を可能にするウーズゲノムは、遺伝学的研究のパフォーマンスに不可欠なツールとなっています。セーフハーバーの遺伝子座は、同質遺伝子の文脈におけるマウスの異なる系統間で比較分析を可能にします。これは、挿入突然変異誘発は、用量依存的な効果、または多彩な導入遺伝子の発現のようなよく知られた制限に関連付けられている標準的なランダムな統合方法を用いて達成することができません。セーフハーバーの遺伝子座における遺伝子編集しやすさと柔軟性は、具体的には(それぞれ、loxP配列またはFRT)標的配列を認識し、同一のターゲット間の効率的な組み換えを触媒するのCreまたはフリッパーゼ(FLPe)などの部位特異的な標的にリコンビナーゼの使用によって増加されます。これらの特性に、事前統合セーフハーバー座でのloxPまたはFRT配列を用いてリコンビナーゼ媒介遺伝子編集は、トランスマウスで使用される一般的なツールです。起源。同一の標的配列との間の媒介カセット挿入または切除することに加えて、非相溶性のloxPまたはFRT部位の使用は、リコンビナーゼ媒介カセット交換を可能にする(RMCE)4。
人間では、実施されたセーフハーバー遺伝子座を識別しようとします。マウスオルソロガスHPRTは、機能喪失レッシュ・ナイハン症候群、およびROSA26との関連にもかかわらずはhPSCsに標的にされてきた。HPRTが急速にROSA26のように、ESCに導入遺伝子の発現をサイレンシングし、することが報告された、中に導入遺伝子の発現を維持する能力7 –最終的に分化した細胞は5を調査しませんでした。 CCR5遺伝子のホモ接合ヌル突然変異がヒトにおいて十分に許容されると思われるので、安全な港としての価値を評価した。CCR5を標的としたESC 8,9を含む様々なヒト細胞株に安定した導入遺伝子の発現を維持することが報告されました。しかしながら、後者は長期培養中にクローンレベルで証明されていなかった、とユビキタス導入遺伝子発現は、3つの胚葉の分化した子孫で実証されていませんでした。AAVS1、アデノ随伴ウイルス2型(AAV)の自然な統合部位を、試験しましたなぜなら10をサイレンシングトランスジーンに報告耐性の、ヒトES細胞でも同様。それ以降、多くのグループは、 インビトロおよびインビボ 2,8,11,12 の両方で 、すべての3つの胚葉のそれらの分化した子孫にAAVS1遺伝子座を用いて、未分化hPSCsに安定な導入遺伝子発現を記載し、ならびに。 AAVS1遺伝子座は、未分化ヒトES細胞及び肝細胞の子孫13のin vitroでの変数の導入遺伝子の阻害を発揮することが判明したとして、最近の結果にもかかわらず、これらの知見をニュアンス。
GENOを見つけることを目的とした単一コピーの組込みを決定するために、ランダムな統合アプローチおよび方法を使用して追加のスクリーニング研究hPSCsの拡大と分化14,15の間に導入遺伝子サイレンシングに耐性マイク組込み部位。全体的に、今まで、何のゲノム部位は完全にhPSCsとその子孫に安全な港として確認されていません。ユビキタス安定した導入遺伝子発現、hPSCsでなく、in vitroおよびin vivoでその区別子孫ではないだけのための適切な部位の同定は、解決されないままです。すべての研究の遺伝子座の中およびその限界にもかかわらず、AAVS1は残る最高の特徴と幹細胞研究に最もよく使用さ。
RMCEが成功裏FLPeがCreを17よりも効率的である兆候があっても、主にCreリコンビナーゼを用いて、これらの遺伝子座6,7,14,16の一部でhPSCsで行われています。これら全ての場合において、一つの正薬物耐性カセットは、組換えコロニーの選択のために使用しました。成功しているが、これらの手順は、標準的な遺伝子 – 以上の技術的進歩を構成するものではありません。ZFNを使用して編集手順、TALENsまたはCRISPR / Cas9は、単一の抗生物質選択の手順として、ランダムな統合を排除し、正確に標的クローンを同定するためにコロニースクリーニングを必要としません。
この手順では、我々は(事前統合カセット内)で±15日間でポリクローナルトランスジェニック株の生成を可能にする選択を(着信カセット内に)正の組み合わせを使用してAAVS1座にhPSCsにRMCEを実行する方法を説明し、負100%効率とランダム組込み事象の自由。したがって、この方法は、hPSCsに現在記載RMCE技術を超えた進歩を表しています。
セーフハーバーの遺伝子座における遺伝子の編集方法がhPSCsに遺伝子導入を開発するために不可欠なツールのまま。 AAVS1のセーフハーバー文字は最近、いくつかのアプリケーション13,18のために疑問視されてきたが、この遺伝子座は、現在、ヒト由来の細胞株で最もよく特徴付けられたまま。 hPSCsでその限界の意識は、信頼性の高いデータを得るのを助けることができます。したがって、AAVS1はまだgain-および機能喪失研究や決定の遺伝的背景内との間の同質遺伝子コンテキストを必要とする要因の誘導性/構成的発現のために、例えば、有用なサイトであることが期待されます。
AAVS1遺伝子座は、ZFNは、TALENまたはCRISPR / Cas9 1,2,19を使用して、多くのグループが標的とされています。これらのヌクレアーゼが大幅に決定された遺伝子座における相同組換えの効率を高めます。しかしながら、この方法では、画面に、完全にランダムINTEGの自由正確に標的クローンを、特徴づけます飼料および多能性およびゲノムの完全性は、(最適化された遺伝子の編集ツールを使用して)3ヶ月かかることがあります維持する( 図3)。最後の二つは、オフターゲットヌクレアーゼ活性によって生成された可能性の突然変異によって引き起こされ得ます。ここで使用されるRMCEシステムは、しかし、リコンビナーゼ特異的標的配列がAAVS1座に事前統合されると、わずか2週間で、この目的を達成するために、迅速、効率的、かつエレガントな方法を提供しています。ポジティブ/ネガティブ選択し、適切な選択プログラムの使用は、RMCEによるAAVS1遺伝子座における遺伝子編集の簡素化に寄与する主な要因です。
新しいトランスジェニック系統の遺伝子型の特徴づけは、かなり(ノークローンスクリーニングが必要ありません)減少し、オフターゲットヌクレアーゼ活性に関連した特徴付けが原因でFRTS用FLPeの特異性に不要レンダリングされます。特徴付けも示すことによってルーチンRMCE実験を低減することができますフルカセット交換とランダム統合の欠如は、すでに十分にPCR( 図2B)によって実証されているので、マスター細胞株( 図2A)からのGFP発現の完全な喪失、およびサザンブロット13。ポジティブ/ネガティブ選択を使用することは、以前の報告との主な相違点を構成します。以前AAVS1または他の遺伝子座のいずれかで、hPSCsにRMCEを説明したいくつかのグループは、単一の正の選択ステップ7,14,16を採用します。コロニーのスクリーニングも同様にクローンレベルで正確な統合およびランダム組込みが存在しないことを実証するために行わなければならないので、これは、ヌクレアーゼを用いて行わ遺伝子編集上の主要な技術的利点を構成しません。
複数のhESC / IPSCラインでこのRMCEシステムの使用は、それぞれ独立したラインのAAVS1座に記載FRT-含むカセットのプレインテグレーションが必要です。しかし、一度生成、その迅速性とシンプルさは、上記の用途のために定義された同質遺伝子設定で、遺伝子スクリーニングは、そうでなければ、技術的に非常に時間がかかるようになり、半高スループットを開発することが可能となります。また、すべてのRMCEベクターは、ZFNを持つ遺伝子座を標的とするために使用PZ AAVS1遺伝子ターゲッティングベクター内に構築されていますが、TALENsまたはCRISPR / Cas9も報告されました。 RMCEベクトルの二重性は、FRTの有無にかかわらずhPSCsで決定された導入遺伝子のための複数の行を生成するのに非常に有用です。例えば、一つのヒットは、理想的には、結果を確認するために、複数のHPSC株で試験する必要があるRMCEによって行わ決定遺伝子スクリーニングに成功が実証されました。複数RMCEに適したマスター細胞株の非存在下では、ヌクレアーゼを用いて、ヒットの標的の直接遺伝子を行うことができました。 RMCEベクトルの二重人格の有用性は、私たちのグループ20によって証明されています。本研究では、遺伝子補正は患者由来で行いました前頭側頭型認知症(FTD) プログラ (PGRN)の発現欠損を引き起こす突然変異を負う性IPSC。 PGRNレベルを回復したカセットのAAVS1遺伝子座でのZFN媒介挿入による遺伝子相補性は、突然変異の存在に関連したcorticogenesisに欠陥表現型を修正しました。加えて、同程度の線は、外因性PGRN発現のためのコントロールとして使用するWTのヒトES細胞においてRMCEによって生成されました。
組換えコロニーが存在しない場合には、RMCEドナーベクターのトランスフェクション効率を確認してください。 30%よりも優れたトランスフェクション効率は、上記に示した結果が得られます。低いトランスフェクション効率は、再結合効率を低下させます。最後に、RMCEシステムはAAVS1遺伝子座で生成されたが、それは、他の遺伝子座にも適用可能です。
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |