Aqui relatamos um método de edição gene rápida e eficiente com base em RMCE no locus AAVS1 de humanos pluripotentes células estaminais (hPSCs) que melhora a sistemas descritos anteriormente. Usando esta técnica, linhas isogênicas pode ser rápida e confiável gerada para estudos comparativos adequados, facilitar a investigação mediada por transgênese com hPSCs.
Mesmo com a revolução das tecnologias de segmentação de genes conduzidos por CRISPR-Cas9, a modificação genética de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) ainda é demorado. Estudos comparativos que usam linhagens recombinantes com transgenes integrados em loci porto seguro poderia beneficiar de abordagens que usam recombinases direcionados site-specific, como Cre ou FLPe, que são mais rápidos e menos propenso a efeitos off-alvo. Tais métodos têm sido descritos, embora não significativamente gene outperform alvo na maioria dos aspectos. Usando nucleases de dedos de zinco, que anteriormente criou uma linha de células de referência no locus AAVS1 de hPSCs que contém um GFP-higromicina-tk expressar cassete, flanqueado por sequências DRF heterotípicos. Aqui, descrevemos os procedimentos para executar FLPe troca cassete mediada por recombinase (RMCE) usando esta linha. O mestre cA linha ell é transfectada com um vector RMCE dador, que contém um promotor de resistência puromicina, e com FLPe recombinase. Aplicação do programa de selecção tanto positiva (puromicina) e negativo (FIAU) conduz à selecção de RMCE sem integrações aleatórias. RMCE gera linhas transgénicas policlonais pluripotentes totalmente caracterizados em 15 d, com uma eficiência de 100%. Apesar do descrito recentemente limitações do locus AAVS1, a facilidade do sistema abre o caminho para HPSC transgenia em ambientes isogênicos, é necessária para estudos comparativos, e permite telas genéticos semi-alto rendimento para o ganho / perda de análise de funções que seria de outra forma ser altamente demorado.
Alvo de recombinação do genoma facilitou os rápidos avanços em muitas áreas de pesquisa. Em camundongos, a sinergia entre a edição genoma e células-tronco tem permitido uma maior compreensão do mecanismo complexo da função dos genes e regulação dos genes. Esse progresso é esperado em células humanas pluripotentes estaminais (hPSCs) bem, embora para muitos anos desde o primeiro isolamento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs), e humano mais tarde induziu células-tronco pluripotentes (hiPSCs), edição gene tem constituído um obstáculo técnico . Recentes avanços em engenharia de genoma utilizando nucleases-zinco-alvo dedo nucleases (ZFNs), transcrição nucleases efetoras ativador-like (TALEN), ou cluster regularmente espaçadas curta repete palindr�icas / proteína associada a CRISPR 9 (CRISPR / Cas9) nos permitiram superar estes dificuldades, tornando recombinação alvo de um processo eficiente 1-3.
loci específicos no mgenoma ouse que permitem a expressão do transgene estável, confiável e ubíqua na ausência de efeitos adversos como Rosa26, Hprt1 ou COL1A1, tornaram-se ferramentas essenciais para a realização de estudos genéticos. loci porto seguro permitir a análise comparáveis entre diferentes linhagens de camundongos em contextos isogênicos. Isto não pode ser conseguida utilizando métodos de integração aleatória convencionais, os quais são associados com limitações bem conhecidas como mutagénese por inserção, efeitos dependentes da dose, ou a expressão do transgene variegada. Gene edição facilidade e flexibilidade na loci porto seguro é aumentada através da utilização de recombinases direcionados site-specific como Cre ou flipase (FLPe), que reconhecem especificamente sequências alvo (loxP ou FRT, respectivamente) e catalisam recombinação eficiente entre alvos idênticos. Devido a estas características, edição de gene mediada por recombinase usando sequências loxP ou FRT em loci porto seguro pré-integrado é uma ferramenta comum usada em rato transgênese. Além disso a inserção de cassetes ou excisão mediada entre as sequências alvo idênticas, o uso de locais loxP ou FRT incompatíveis permite a troca de cassete mediada por recombinase (RMCE) 4.
No ser humano, as tentativas para identificar loci portuárias seguras foram realizadas. O HPRT ortóloga rato, apesar de sua associação com a síndrome de perda de função de Lesch-Nyhan, e ROSA26 foram alvo de hPSCs. HPRT foi relatado para silenciar rapidamente a expressão do transgene em ESC e, como ROSA26, sua capacidade de sustentar a expressão do transgene em terminalmente células diferenciadas não foi investigada 5-7. Uma vez que uma mutação nula homozigótica do gene CCR5 parece ser bem tolerada em seres humanos, o seu valor como zona de protecção foi avaliada. CCR5 foi orientada e relatado para manter a expressão do transgene estável em diferentes linhas de células humanas, incluindo CES 8,9. Contudo,esta última não foi comprovado ao nível clonal durante a cultura a longo prazo, e a expressão do transgene ubíqua não foi demonstrada na progenia diferenciada das três camadas germinais. AAVS1, o sítio de integração natural do Adeno Associated Vírus tipo 2 (AAV), foi testada em hESCs assim, por causa da resistência relatado para transgene silenciar 10. Mais tarde, vários grupos utilizado o locus AAVS1 e descrita a expressão do transgene estável no hPSCs indiferenciadas, bem como na sua progénie diferenciada de todas as três camadas germinais, tanto in vitro como in vivo 2,8,11,12. Os resultados recentes, no entanto, matizar estes achados, como o locus AAVS1 foi encontrado para exercer a inibição transgene variável in vitro em hESCs indiferenciadas e em hepatócitos progênie 13.
Estudos adicionais da seleção utilizando abordagens de integração aleatórios e métodos para determinar a integração cópia única destinada a encontrar genolocais de integração de microfone resistentes ao silenciamento do transgene durante a expansão e diferenciação hPSCs 14,15. No geral, até agora, nenhum site genômico foi totalmente validado como um porto seguro em hPSCs e seus descendentes; identificação de um local apropriado para a expressão do transgene estável ubíqua, não só em hPSCs mas também em suas progênies diferenciadas in vitro e in vivo, permanece a ser resolvido. Entre todos os loci estudados e apesar das suas limitações, AAVS1 continua a ser o melhor caracterizados e mais utilizado na investigação sobre células estaminais.
RMCE foi realizado com sucesso em hPSCs em alguns desses loci 6,7,14,16, utilizando principalmente Cre recombinase, mesmo se houver indícios de que FLPe é mais eficiente que Cre 17. Em todos estes casos, uma cassete de resistência à droga positivo foi utilizado para a selecção de colónias recombinantes. Embora bem sucedido, esses procedimentos não constituem um avanço técnico sobre gene-padrãoprocedimentos de edição usando ZFNs, TALENS ou CRISPR / Cas9, como um único processo de selecção de antibiótico não descarta integrações aleatórias e requer triagem colónia para identificar clones corretamente direcionados.
Neste procedimento, que descrevem métodos para realizar RMCE em hPSCs no locus AAVS1 usando uma combinação de positivo (dentro da cassete de entrada) e negativo (dentro da cassete pré-integrado) selecções que permitem a geração de linhas transgénicas policlonais em ± 15 dias com a 100% de eficiência e livre de eventos de integração aleatórios. Portanto, este método representa um progresso além das tecnologias RMCE atualmente descritos em hPSCs.
métodos de edição Gene em loci porto seguro continuam a ser uma ferramenta essencial para desenvolver transgenia em hPSCs. Embora o personagem porto seguro de AAVS1 recentemente tem sido questionada por alguns aplicativos 13,18, esse locus permanece atualmente o melhor caracterizada em linhas de células de origem humana. Consciência das suas limitações em hPSCs pode ajudar a obter dados fiáveis. Portanto, AAVS1 ainda deverá ser um local útil, por exemplo, para estudos gain- e perda de função ou expressão indutível / constitutivo de factores que exigem um contexto isogénica dentro e entre os fundos genéticos determinados.
O locus AAVS1 tem sido alvo de muitos grupos usando ZFNs, TALEN ou CRISPR / Cas9 1,2,19. Estas nucleases aumentar significativamente a eficiência de recombinação homóloga no locus de um determinado. No entanto, o processo para rastrear e caracterizar plenamente clones corretamente direcionados, livres de integ aleatórioração e para manter a pluripotência e genoma integridade pode levar até 3 meses (utilizando ferramentas de edição gene Optimized) (Figura 3). Os dois últimos pode ser causada por mutações possíveis gerados pela actividade da nuclease fora do alvo. O sistema RMCE utilizado aqui, no entanto, oferece um método rápido, eficiente, e elegante para atingir este objectivo em apenas duas semanas, uma vez que as sequências alvo de recombinase específica do são pré-integrado dentro do locus de AAVS1. Uso de selecção positiva / negativa e um programa de seleção adequada são os principais fatores que contribuem para a simplificação da edição gene no locus AAVS1 por RMCE.
Caracterização genotípica das novas linhagens transgênicas é significativamente reduzida (sem triagem clonal é necessário), e caracterização associada à atividade nuclease fora do alvo é processado dispensável devido à especificidade de FLPe para FRT. A caracterização também pode ser reduzida em experiências de rotina por RMCE demonstrando aperda completa da expressão de GFP a partir da linha de células de referência (Figura 2A), porque a troca de cassete completo e falta de integração aleatória foram já suficientemente demonstrado por PCR (Figura 2B) e 13 de transferência de Southern. O uso de selecção positiva / negativa também constitui a principal diferença com relatórios anteriores. Vários grupos que anteriormente descritos em RMCE hPSCs, quer na AAVS1 ou outros loci, empregue apenas um único passo de selecção positiva 7,14,16. Isto não constitui uma grande vantagem técnica sobre a edição do gene realizada com nucleases, porque o rastreio colónia tem de ser igualmente realizada para demonstrar a integração e a ausência de integração aleatória correcta ao nível clonal.
A utilização deste sistema RMCE em várias linhas de células estaminais embrionárias humanas / IPSC requer pré-integração do descrito FRT contendo cassete no locus AAVS1 de cada linha independente. No entanto, uma vez gerado,sua rapidez e simplicidade faz com que seja possível desenvolver semi-alto rendimento telas genéticos em configurações isogénicas definidos para as aplicações acima mencionadas que de outra forma seria tecnicamente muito demorado. Além disso, todos os vectores de RMCE são construídas dentro do vector de direccionamento do gene pZ AAVS1 utilizado para segmentar o locus com ZFNs, mas TALENS ou CRISPR / Cas9 também foram relatados. dualidade do vector RMCE é muito útil para gerar múltiplas linhas para um determinado transgene em hPSCs com ou sem FRT. Por exemplo, uma batida demonstrado sucesso em uma tela genética determinado realizada por RMCE seria idealmente devem ser testados em várias linhas HPSC para confirmar os resultados. Na ausência de várias linhas de células mestras RMCE-adequada, directa do gene segmentação do sucesso utilizando nucleases pode ser realizada. A utilidade do caráter dual dos vetores RMCE foi provado pelo nosso grupo 20. Neste estudo, a correcção de genes foi efectuada em paciente derivadoA demência frontotemporal (FTD) iPSCs que carregam uma mutação que causa deficiência de expressão progranulina (PGRN). Gene complementação pela inserção ZFNs-mediadas no locus AAVS1 de uma cassete que restabeleceu os níveis PGRN, corrigiu o fenótipo defeituoso em corticogenesis associada com a presença da mutação. Além disso, uma linha comparável foi gerado por RMCE em hESCs WT para ser utilizado como controlo para a expressão PGRN exógeno.
Na ausência de colónias recombinantes, verificar a eficiência de transfecção do vector RMCE dador. eficiências de transfecção superior a 30% deu os resultados indicados acima. Menor nível de eficiência de transfecção diminuir a eficiência de recombinação. Finalmente, o sistema RMCE foi gerado no locus AAVS1, mas é aplicável a qualquer outro local.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |