This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.
बैक्टीरियल biofilms अक्सर फंगल सतहों पर फार्म और इस तरह के चयापचय सहयोग, प्रतियोगिता, या शिकार के रूप में कई बैक्टीरियल फंगल बातचीत प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है। biofilms के अध्ययन पर्यावरण विज्ञान, खाद्य उत्पादन, और चिकित्सा सहित कई जैविक क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है। हालांकि, कुछ अध्ययनों से आंशिक रूप से उन्हें जांच की कठिनाई के कारण, इस तरह के जीवाणु biofilms पर ध्यान केंद्रित किया है। गुणात्मक और मात्रात्मक biofilm के लिए तरीके साहित्य में वर्णित विश्लेषण के अधिकांश अजैव सतहों पर या इस तरह के उपकला कोशिकाओं की एक monolayer के रूप में सजातीय और पतली जैविक सतहों पर बनाने biofilms के लिए ही उपयुक्त हैं।
जबकि लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी (एल एस सी एम) अक्सर सीटू और इन विवो biofilms में विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इस तकनीक बहुत ही चुनौतीपूर्ण जब फंगल hyphae पर बैक्टीरियल biofilms के लिए आवेदन किया, मोटाई और hyphal netw के तीन आयाम के कारण हो जाता हैorks। इस कमी को दूर करने के लिए, हम फंगल कालोनियों में hyphal परतों के संचय को सीमित करने की एक विधि के साथ माइक्रोस्कोपी के संयोजन एक प्रोटोकॉल विकसित की है। इस पद्धति का उपयोग करके, हम दोनों एल एस सी एम और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर कई पैमानों पर फंगल hyphae पर बैक्टीरियल biofilms के विकास की जांच करने में सक्षम थे। इस रिपोर्ट में सूक्ष्मजीव संस्कृतियों, जीवाणु biofilm गठन की स्थिति, biofilm धुंधला हो जाना, और एल एस सी एम और SEM दृश्यावलोकन सहित प्रोटोकॉल का वर्णन है।
कवक और बैक्टीरिया एक दूसरे के साथ बातचीत करने के लिए है क्योंकि वे सबसे स्थलीय वातावरण में रहना कई अवसर हैं। उनकी विविधता और उनकी सर्वव्यापकता के कारण, इन मुलाकातों जैव प्रौद्योगिकी, कृषि, खाद्य प्रसंस्करण, और दवा के 1, 2 सहित कई जैविक क्षेत्रों में महत्वपूर्ण हैं। आणविक बातचीत भागीदारों के बीच आदान-प्रदान को अनुमति देने के लिए निकटता की एक निश्चित डिग्री की आवश्यकता होती है, और कुछ मामलों में, भागीदारों के एक भौतिक एसोसिएशन एक कार्यात्मक बातचीत 3 के लिए आवश्यक है। बैक्टीरिया और कवक के बीच एक आम शारीरिक एसोसिएशन फंगल सतहों 4 पर बैक्टीरियल biofilms के गठन है। बैक्टीरियल कोशिकाओं और कवक hyphae के बीच यह सीधा संपर्क अंतरंग बातचीत है कि विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, चिकित्सा, oppor पर Pseudomonas aeruginosa की biofilm गठन के अध्ययन मेंtunistic कवक रोगज़नक़ कैंडिडा सफेद biofilm गठन और डाह 5 के बीच की कड़ी में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। कृषि में, अध्ययनों से संकेत मिलता है कि संयंत्र से विकास को बढ़ावा देने के rhizobacteria और जैव नियंत्रण बैक्टीरिया एक वृद्धि की दक्षता जब एक मिश्रित biofilm में एक कवक के साथ जुड़े है। उदाहरण के लिए, Bradyrhizobium elkanii जब एक मिश्रित biofilm 6 में Pleurotus ostreatus के साथ जुड़े एन 2 -fixing गतिविधि में वृद्धि की है। अंत में, जैविक उपचार में, बैक्टीरियल कवक मिश्रित biofilms प्रदूषित साइटों 7 के remediation, 8 के लिए इस्तेमाल किया गया है।
एल एस सी एम विशेष रूप से biofilms का अध्ययन करने के बाद से यह न्यूनतम pretreatments साथ हाइड्रेटेड biofilms रहने वाले जिससे biofilm संरचना और संगठन बनाए रखने का एक तीन आयामी अवलोकन के लिए अनुमति देता है उपयुक्त है। इस प्रकार, एल एस सी एम द्वारा biofilm विश्लेषण बहुत जानकारीपूर्ण है, विशेष रूप से करने के लिए detएक परिपक्व biofilm के विकास के लिए आसंजन कदम से, biofilm गठन के समय पाठ्यक्रम और विशेषता चरणों 9, 10 का पता लगाने के एमिन। यह भी विशेष रूप से biofilm संरचना और मैट्रिक्स 11, 12 कल्पना करने के लिए या biofilm आकार 13, 14 यों के लिए अनुकूल है। हालांकि इस पद्धति अजैव या पतली जैविक सतहों पर biofilms अध्ययन करने के लिए, एक कवक filamentous कॉलोनी पर जीवाणु biofilm का अध्ययन उपयुक्त है अभी भी बहुत चुनौतीपूर्ण है। वास्तव में, सबसे filamentous कवक संस्कृति में मोटी, जटिल, tridimensional नेटवर्क का निर्माण। मोटी वस्तुओं confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है, भले ही लेजर प्रवेश की क्षीणन और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अक्सर 50 माइक्रोन 15 की गहराई पर अंतिम छवियों की गुणवत्ता में कमी। इसके अलावा, क्योंकि कवक कालोनियों कठोर नहीं हैं, मैंटी biofilms परेशान बिना सूक्ष्मजीवों को संभालने के लिए मुश्किल है। नमूनों की मोटाई के कारण, फंगल hyphae पर बैक्टीरियल biofilms के कुछ सूक्ष्म विश्लेषण आमतौर पर केवल फंगल कॉलोनी के एक छोटे से हिस्से पर इसलिए केवल कुछ hyphae 16, 17, 18 से युक्त प्रदर्शन कर रहे हैं। यह सब फंगल कॉलोनी पर biofilm वितरण का वर्णन करने की हमारी क्षमता को सीमित करता है और इस तरह फंगल कॉलोनी के भीतर biofilm की heterogenic वितरण के मामले में विश्लेषण में पूर्वाग्रहों को ला सकते हैं।
ऐसी कठिनाइयों को दूर करने के लिए, हम विकास और फंगल hyphae पर जीवाणु biofilm के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट। इस विधि biofilm गठन का अध्ययन करने के स्यूडोमोनास ectomycorrhizal basidiomycete Laccaria bicolor S238N की hyphae पर BBc6 fluorescens में लागू किया गया था। इन दो वन-मिट्टी सूक्ष्मजीवों पहले से मिश्रित रूप को वर्णित किया गयाbiofilm संरचनाओं की तरह 19, 20। इस विधि को आसानी से आगे अन्य filamentous कवक / बैक्टीरिया का प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत विधि एक कवक संस्कृति विधि के संयोजन पर आधारित है, बहुत पतली फंगल कालोनियों के विकास, एल एस सी एम और SEM इमेजिंग के साथ के लिए अनुमति देता है। यह सूक्ष्म (माइक्रोन रेंज) को प्राप्त करने और meso- (मिमी रेंज) के लिए दो सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के विचारों के पैमाने पर अमेरिकी अनुमति दी, biofilm के गुणात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। हम यह भी पता चला है कि नमूने नैनो पैमाने स्तर (एनएम रेंज) पर biofilm की संरचनात्मक विश्लेषण की अनुमति देने SEM के साथ मनाया जा सकता है।
Bacterial biofilms are retrieved in many environments and have been studied since the 1950s, leading to the development of a number of methods to analyze them24. Classical methods to quantify and monitor biofilms include micro-titer assays and, the most widely-used method, crystal violet (CV) staining. These methods are fast, low cost, and easy to handle25 and are particularly useful to quantify total biofilm biomass or to perform viability and matrix quantification assays. On an other hand, "omics" methods are also useful in biofilm studies, allowing for quantitative and functional analyses of biofilms26,27. Despite the advantages of micro-titer plate and "omics" methods, several essential features of biofilms cannot be captured with these techniques, hindering a complete understanding of this process. Such features include matrix structures, bacterial colony architectures, cell/cell interactions, and colonization patterns, which are key data for understanding both the functioning of biofilms and the dynamics of their formation. Despite the capacity of microscopy to capture these features, microscopy analysis of bacterial biofilms on filamentous fungi are still scarce. This is mainly due to the growth of filamentous fungi, which often forms colonies of thick, complex, tridimensional networks. Formation of bacterial biofilms on fungi is common in diverse environments and is significantly involved in various fields4 (e.g., medicine, agriculture, and environment); hence, it is critical to develop new methods to facilitate their investigation. To this end, we combined a method to generate very thin fungal colonies with microscopic imaging of the bacterial biofilms. In addition, we proposed a set of microscopy tools to qualitatively analyze those biofilms. The success of the method relies upon the ability to produce very thin hyphal colonies and to apply the appropriate dyes. These points are discussed below.
Due to the complex structures of the biofilms, understanding their function requires a multi-scale approach28,29. Distribution patterns of the biofilms, bacterial colony architecture, and matrix structure and composition are analyzed at different scales (i.e., meso-scale and micro-scale). Moreover, nanoscale resolution allows access to the cell/cell physical interactions and the nano-structure of the matrix. Thus, the developed method easily enables a multi-scale analysis of the bacterial biofilms formed on the fungal colony.
In most studies, LSCM analyses of biofilms are limited to the micro-scale, the meso-scale usually being performed by optical coherence tomography30,31,32. The method presented here enables both micro- and meso-scale analyses by LSCM. It demonstrates the utility of combining both analyses in the same region of the sample and even on the same image using new-generation confocal microscopes with high resolution (Figure 3). Thus, issues linked to compiled data gathered at different scales with different methods are here avoided.
This combination of analyses gave access concomitantly to the biofilm repartition on the fungal colony, the bacterial colony architecture along the developing biofilm, and the matrix structure. The meso-scale analysis showed a heterogenic distribution of the bacterial biofilms on the fungal colonies (Figures 2 and 3). This observation would not have been possible with protocols that only permit imaging of a small portion of the fungal colony, which is not necessarily representative of the entire colony. Thus, while often neglected, the meso-scale analysis can give precious information about biofilm distribution patterns.
Finally, the developed method can be used to analyze samples with different microscopy techniques, including scanning electron microscopy. Here, SEM was used to reach the nano-scale and to obtain the bacterial spatial organization within the biofilm. It performed very well with the thin fungal colonies, while SEM only permitted surface imaging. In contrast to LSCM, SEM, however, required sample dehydration and, most often, coating with a conductive metal. This dehydration process might alter biological structures when it is not properly executed and may require optimization. Here, sample dehydration using slow lyophilization was used33. Nevertheless, applying both LSCM and SEM to the samples will allow the performance of correlative microscopy at the same location of the sample.
Despite the advantages described above, some limitations exist. Firstly, it may not be applicable to all kind of fungi. Indeed, this culturing method is developed for fungi spreading radially on the surface of solid media. This method may not be suitable for fungi forming mainly aerial hyphae (e.g., Fusarium sp.) or for micro-aerobic fungi spreading mainly inside agar. Moreover, fungi degrading cellophane may be problematic as well (e.g., Trichoderma sp.). Secondly, it is important to note that the staining strategy is a critical point and the choice of the stain must be made carefully, as the stain must not disturb the biofilm. For example, we noticed that Calcofluor White caused partial biofilm disruption (data not shown), likely due to the high pH of this stain. Also, some dyes produced heterogeneous staining (e.g., Congo Red), while others produced homogeneous staining (e.g., cell wall staining with WGA lectin), giving a heterogeneous image quality. Moreover, it is important to be aware that some dyes might not be fully specific. For example, WGA stains not only fungal cell walls but also N-acetylneuraminic acid in gram-positive bacterial cell walls and adhesins produced by gram-positive and -negative bacteria during biofilm formation34,35. Therefore, using fluorescent protein-tagged bacteria and/or fungi is recommended to avoid multiple staining. If multiple dyes are used, they must not chemically interfere, and their emission spectra should not overlap.
Meso-scale analyses require a large scanned area, and therefore, LSCM may be time-consuming (40 min to 1 hr, depending on the sample thickness) and bottleneck the analysis of a large number of samples. Nonetheless, adjustments can be made depending on the type of data required. It is possible to decrease acquisition time and image size by altering the image quality. For example, high resolution is not necessary to analyze the biofilm general repartition.
Finally, some limitations need to be considered when choosing to display Z- stack data as 2D or 3D projections. Two-dimensional projections are a good way to summarize data, but depth information is lost, and overlapped structures become hidden. On the other hand, 3D projections allow the visualization from different points of view, but they often render poorly in case of spatial complexity.
In conclusion, we have reported a method for the characterization of bacterial biofilms on hyphae at the structural level. The methodology can be extended to other applications. Indeed, this method allows the performance of functional or chemical characterization of bacterial biofilms forming on fungal hyphae. Due to the great variety of existing fluorescent reporter systems, LSCM analysis can be used for multiple purposes29. For example, the fluorescence microscopy could be used to monitor pH gradient36 or molecule diffusion in biofilms37. Additionally, the method allows for community analysis in multispecies biofilms. For example, fluorescence in situ hybridization targeting specific bacterial groups is particularly useful to study specific bacterial repartition in multispecies biofilms38,39. Last, numerous fluorescent dyes can be used to characterize the matrix composition of the biofilms21. Here, proteins were targeted using Sypro, which stains a large range of proteins, among them matrix proteins (Figure 4), but other dyes allow for the visualization of other important matrix constituents, such as exopolysaccharides or extracellular DNA. Interestingly, all these analyses could be performed at the meso-scale using the described method. Since LSCM can be performed on living samples, it is also possible to achieve time-lapse imaging using, for example, coverwell chambers, particularly suitable for thin fungal colonies. This option is particularly interesting, as biofilm formation is a complex, dynamic process. Finally, for a quantitative purpose, the reported method may improve the accuracy of automatic quantitative analysis by making this quantification possible on meso-scale images. This may overcome biofilm heterogeneity and statistical issues29.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.
6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |