Denne protokol beskriver en ny metode til at vokse og kvalitativt analysere bakterielle biofilm på svampehyfer ved konfokal og elektronmikroskopi.
Bakterielle biofilm ofte dannes på svampeangreb overflader og kan være involveret i en lang række bakterielle-svampe interaktion processer, såsom metabolisk samarbejde, konkurrence, eller prædation. Studiet af biofilm er vigtig i mange biologiske områder, herunder miljøvidenskab, fødevareproduktion, og medicin. Imidlertid har kun få undersøgelser fokuseret på sådanne bakterielle biofilm, delvist på grund af vanskeligheden ved at undersøge dem. De fleste af metoderne til kvalitativ og kvantitativ biofilm analyser beskrevet i litteraturen, er kun egnet til biofilm dannes på abiotiske overflader eller på homogene og tynde biotiske overflader, såsom et monolag af epitelceller.
Mens laserscanning konfokal mikroskopi (LSCM) ofte anvendes til at analysere in situ og in vivo biofilm, denne teknologi bliver meget udfordrende, når den anvendes til bakterielle biofilm på svampehyfer, på grund af tykkelsen og de tre dimensioner af hyfe netvorks. For at overvinde denne ulempe udviklede vi en protokol kombinere mikroskopi med en metode til at begrænse akkumuleringen af svampetrådenes lag i fungale kolonier. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at undersøge udviklingen af bakterielle biofilm på svampehyfer på flere skalaer ved hjælp af både LSCM og scanning elektronmikroskopi (SEM). Denne rapport beskriver den protokol, herunder mikroorganismekulturer, bakterielle biofilm dannelse betingelser, biofilm farvning og LSCM og SEM visualiseringer.
Svampe og bakterier har mange muligheder for at interagere med hinanden, fordi de bor sammen i de fleste terrestriske miljøer. På grund af deres mangfoldighed og deres allestedsnærværelse, disse interaktioner er vigtige i mange biologiske områder, herunder bioteknologi, landbrug, fødevareforarbejdning, og medicin 1, 2. Molekylære interaktioner kræver en vis grad af nærhed til at tillade udvekslinger mellem partnerne, og i nogle tilfælde, en fysisk association af partnerne er nødvendig for en funktionel interaktion 3. En fælles fysisk association mellem bakterier og svampe er dannelsen af bakterielle biofilm på fungale overflader 4. Denne direkte kontakt mellem bakterieceller og svampehyfer tillader intime interaktioner, der er involveret i forskellige biologiske processer. For eksempel, i medicin, undersøgelse af biofilmdannelse af Pseudomonas aeruginosa på opportunistisk svampe patogen Candida albicans kunne give indsigt i sammenhængen mellem biofilm dannelse og virulens fem. På landbrugsområdet undersøgelser tyder på, at plante-vækstfremmende Rhizobakterier og biologisk bekæmpelse bakterier har en øget effektivitet, når forbundet med en svamp i et blandet biofilm. For eksempel har Bradyrhizobium elkanii forbedret N2 -fixing aktivitet, når forbundet med Pleurotus ostreatus i et blandet biofilm 6. Endelig i bioremediering, bakteriel-svampe blandede biofilm har været brugt til rensning af forurenede lokaliteter 7, 8.
LSCM er særligt velegnet til at studere biofilm, da det giver mulighed for en tredimensionel observation af levende hydreret biofilm med minimum forbehandlinger, og dermed bevare biofilm struktur og organisation. Således biofilm analyse af LSCM er meget informativ, især til DetHermelin tidsforløbet af biofilmdannelse og påvisning af karakteristiske faser 9, 10, fra adhæsion trin i udviklingen af en moden biofilm. Det er også særligt egnet til at visualisere biofilm struktur og matrix 11, 12 eller at kvantificere biofilmen størrelse 13, 14. Selv om denne fremgangsmåde er egnet til at studere biofilm på abiotiske eller tynde biotiske overflader, studere bakteriel biofilm på en fungal filamentøs koloni er stadig meget udfordrende. Faktisk de fleste trådsvampe bygge tykke, komplekse, tredimensionale netværk i kultur. Selv om tykke objekter kan afbildes ved konfokal mikroskopi, dæmpningen af laseren penetration og fluorescensemissionen ofte forringe kvaliteten af de endelige billeder over en dybde på 50 um 15. Endvidere fordi fungale kolonier er ikke stive, it er vanskeligt at håndtere mikroorganismerne uden at forstyrre biofilm. På grund af tykkelsen af prøverne, er de få mikroskopiske analyser af bakterielle biofilm på svampehyfer normalt kun udføres på en lille del af det fungale koloni, derfor kun indeholdende få hyfer 16, 17, 18. Alt dette begrænser vores evne til at beskrive biofilm distribution på den fungale koloni og således kan bringe bias i analysen i tilfælde af den heterogene fordeling af biofilmen inden svampens koloni.
For at overvinde sådanne vanskeligheder, rapporterer vi en fremgangsmåde til vækst og analyse af bakteriel biofilm på svampehyfer. Denne metode blev anvendt til at studere biofilmdannelse i Pseudomonas fluorescens BBc6 på hyfer af ectomycorrhizal basidiomycete Laccaria bicolor S238N. Disse to skov-jordens mikroorganismer blev beskrevet tidligere at danne blandedebiofilm-lignende strukturer 19, 20. Denne metode kan let tilpasses yderligere til andre filamentøse fungale / bakterielle systemer. Fremgangsmåden præsenteres her, er baseret på kombinationen af en fungal kultur fremgangsmåde, der giver mulighed for vækst af meget tynde fungale kolonier, med LSCM og SEM billeddannelse. Dette muliggjorde for os at opnå mikro- (um) og meso- (mm interval) skala visninger af interaktionen mellem de to mikroorganismer, der giver mulighed for den kvalitative karakterisering af biofilmen. Vi viste også, at prøverne kan iagttages med SEM, tillader strukturanalyse af biofilmen på nanoskala (nm).
Bakterielle biofilm hentes i mange miljøer og er blevet studeret siden 1950'erne, hvilket fører til udviklingen af en række metoder til at analysere dem 24. Klassiske metoder til at kvantificere og overvåge biofilm omfatter mikro-titer assays og, den mest udbredte metode, krystalviolet (CV) farvning. Disse fremgangsmåder er hurtige, billige og let at håndtere 25 og er især anvendelige til at kvantificere totale biofilm biomasse eller at udføre levedygtighed og matrix kvantificering assays. På en anden side "omik" metoder er også anvendelige i biofilm undersøgelser, der giver mulighed for kvantitative og funktionelle analyser af biofilm 26, 27. Trods af fordelene ved mikrotiterplade og "omics" metoder kan flere væsentlige kendetegn ved biofilm ikke indfanges med disse teknikker, hindrer en fuldstændig forståelse af denne proces. Sådanne funktioner omfatter matrix strukturs, bakterielle koloni arkitekturer, celle / celle-interaktioner, og kolonisering mønstre, som er vigtige data for at forstå både funktion biofilm og dynamikken i deres dannelse. Trods kapaciteten af mikroskopi til at indfange disse funktioner, mikroskopi analyse af bakterielle biofilm på filamentøse svampe er stadig sparsom. Dette skyldes primært væksten af filamentøse svampe, som ofte danner kolonier af tykke, komplekse, tredimensionale netværk. Dannelse af bakterielle biofilm på svampe er almindelig i forskellige miljøer og er signifikant involveret i forskellige områder 4 (fx medicin, landbrug og miljø.); Derfor er det vigtigt at udvikle nye metoder til at lette deres undersøgelse. Til dette formål har vi kombinerede en metode til at generere meget tynde fungale kolonier med mikroskopisk billeddannelse af de bakterielle biofilm. Desuden foreslog vi et sæt mikroskopi værktøjer til kvalitativt analysere disse biofilm. Succesen med fremgangsmåden afhængigevnen til at producere meget tynde svampetrådenes kolonier og anvende de relevante farvestoffer. Disse punkter er beskrevet nedenfor.
På grund af de komplekse strukturer af biofilm, forstå deres funktion kræver en multi-skala tilgang 28, 29. Distribution mønstre af biofilm, bakteriel koloni arkitektur, og matrix struktur og sammensætning analyseres på forskellige skalaer (dvs. meso-skala og mikro-skala). Desuden nanoskala giver adgang til celle / celle-fysiske interaktioner og nanostruktur af matricen. Således er den udviklede metode nemt kan en multi-skala analyse af de bakterielle biofilm dannet på den fungale koloni.
I de fleste undersøgelser, LSCM analyser af biofilm er begrænset til mikroskala, meso-skala normalt udføres af optisk kohærens tomografi 30, 31, <supclass = "xref"> 32. Metoden præsenteres her giver både mikro- og meso-skala-analyser ved LSCM. Det viser nytten af at kombinere begge analyser i samme region af prøven og endda på det samme billede ved hjælp af den nye generation af konfokale mikroskoper med høj opløsning (figur 3). Således spørgsmål i forbindelse med indsamlede data indsamlet på forskellige skalaer med forskellige metoder her undgået.
Denne kombination af analyser gav adgang samtidigt til biofilmen fordelingen på den fungale koloni, den bakterielle koloni arkitektur langs udvikle biofilm, og matrix-struktur. Meso-skala-analyse viste en heterogen fordeling af de bakterielle biofilm på de fungale kolonier (figur 2 og 3). Denne observation ville ikke have været muligt med protokoller, der kun tillader billeddannelse af en lille del af det fungale koloni, der ikke nødvendigvis er repræsentative for hele kolonien. Medensofte overset, meso-skala analyse kan give værdifulde oplysninger om biofilm fordelingsmønster.
Endelig kan den udviklede metode anvendes til at analysere prøver med forskellige mikroskopiteknikker, herunder scanning elektronmikroskopi. Her blev SEM bruges til at nå nanoskala og for at opnå den bakterielle rumlige organisation inden biofilmen. Det udførte meget godt med de tynde svampekolonier, mens SEM kun tilladt overflade billeddannelse. I modsætning til LSCM, SEM, dog kræves prøve dehydrering og, oftest, belægning med en ledende metal. Denne dehydrering proces kan ændre biologiske strukturer, når det ikke er korrekt udført, og kan kræve optimering. Her blev prøve dehydrering ved hjælp langsom frysetørring anvendt 33. Ikke desto mindre vil anvende både LSCM og SEM til prøverne tillader udførelse af korrelativ mikroskopi på samme sted af prøven.
På trods af fordelenebeskrevet ovenfor, er der visse begrænsninger. For det første kan det ikke være gældende for alle slags svampe. Faktisk er denne dyrkningsmetode udviklet for svampe spredes radialt på overfladen af faste medier. Denne metode kan ikke være egnet for svampe, der danner hovedsageligt lufthyfer (f.eks Fusarium sp.) Eller til mikro-aerob svampe spredes hovedsageligt inde agar. Desuden kan svampe nedbrydende cellofan være problematisk samt (f.eks., Trichoderma sp.). For det andet er det vigtigt at bemærke, at farvningen strategi er et kritisk punkt og valget af pletten skal foretages omhyggeligt, da pletten ikke må forstyrre biofilmen. For eksempel bemærkede vi, at Calcofluor White forårsagede delvis biofilm afbrydelse (data ikke vist), sandsynligvis på grund af den høje pH af denne plet. Også nogle farvestoffer produceret heterogen farvning (f.eks., Congo Red), mens andre producerede homogen farvning (f.eks., Cellevæggen farvning med WGA-lectin), hvilket giver en heterogen billedkvalitet.Desuden er det vigtigt at være opmærksom på at nogle farvestoffer måske ikke være helt specifik. For eksempel WGA pletter ikke kun fungal celle vægge, men også N-acetylneuraminsyre i grampositive bakterielle cellevægge og adhæsiner produceret af gram-positive og -negative bakterier under biofilmdannelse 34, 35. Derfor bruger fluorescerende protein-mærkede bakterier og / eller svampe anbefales at undgå multipel farvning. Hvis der anvendes flere farvestoffer, må de ikke kemisk blande sig, og deres emissionsspektre bør ikke overlappe.
Meso-skala analyser kræver et stort scanningsområde, og derfor kan LSCM være tidskrævende (40 min til 1 time, afhængigt af tykkelsen prøve) og flaskehals analyse af et stort antal prøver. Ikke desto mindre kan justeringer gøres afhængigt af typen af data, der kræves. Det er muligt at reducere erhvervelse tid og billedstørrelse ved at ændre billedkvaliteten. For eksempel, høj opløsninger ikke nødvendigt at analysere biofilmen generelle fordeling.
Endelig skal overvejes, når du vælger at vise Z-stack data som 2D eller 3D projektioner nogle begrænsninger. To-dimensionelle fremskrivninger er en god måde at opsummere data, men oplysninger dybde er tabt, og overlappede strukturer bliver skjult. På den anden side, 3D projektioner tillader visualisering fra forskellige synsvinkler, men de ofte gør dårligt i tilfælde af rumlig kompleksitet.
Som konklusion har vi rapporteret en fremgangsmåde til karakterisering af bakterielle biofilm på hyfer på det strukturelle niveau. Metoden kan udvides til andre programmer. Faktisk har denne fremgangsmåde tillader udførelsen af funktionelle eller kemisk karakterisering af bakterielle biofilm dannes på svampehyfer. På grund af det store udvalg af eksisterende fluorescerende reporter-systemer, kan LSCM analyse bruges til flere formål 29. For eksempel fluorescensen microscopy kunne anvendes til at overvåge pH-gradient 36 eller molekyle diffusion i biofilm 37. Derudover metoden giver mulighed for fællesskab analyse i flere arter biofilm. For eksempel, fluorescens in situ hybridisering rettet mod specifikke bakterielle grupper er særligt nyttigt at studere specifikke bakteriel fordeling i flere arter biofilm 38, 39. Last, talrige fluorescerende farvestoffer kan anvendes til at karakterisere matrix sammensætning af biofilm 21. Her blev proteiner målrettet anvendelse af SYPRO, som farver en lang række proteiner, deriblandt matrixproteiner (figur 4), men andre farvestoffer muliggøre visualisering af andre vigtige matrixbestanddele, såsom exopolysaccharider eller ekstracellulært DNA. Interessant nok kunne alle disse analyser udføres på meso-skala ved anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde. Da LSCM kan udføres på levende prøver,det er også muligt at opnå time-lapse billeddannelse ved anvendelse af for eksempel coverwell kamre, særligt velegnet til tynde fungale kolonier. Denne mulighed er særlig interessant, da biofilmdannelse er en kompleks, dynamisk proces. Endelig en kvantitativ formål kan den rapporterede metode forbedre nøjagtigheden af automatiske kvantitativ analyse ved at gøre denne kvantificering mulig på meso-skala billeder. Dette kan overvinde biofilm heterogenitet og statistiske spørgsmål 29.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.
6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |