In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Styring af ekspressionen eller aktiviteten af specifikke gener gennem myocardial levering af genetisk materiale i murine modeller tillader undersøgelse af genfunktioner. Deres terapeutiske potentiale i hjertet kan også bestemmes. Der er begrænsede tilgange til in vivo molekylær intervention i muse hjerte. Rekombinant adenoassocieret virus (rAAV) -baseret genom engineering er blevet udnyttet som et vigtigt redskab til in vivo cardiac genmanipulation. De specifikke fordele ved denne teknologi omfatter høj effektivitet, høj specificitet, lav genomisk integration sats, minimal immunogenicitet, og minimal patogenicitet. Her er en detaljeret procedure til at konstruere, pakke, og rense rAAV9 vektorer beskrevet. Subkutan injektion af rAAV9 i neonatale hvalpe resulterer i robust ekspression eller effektiv knockdown af genet (er) af interesse i muse hjertet, men ikke i leveren og andre væv. Brug af hjerte–specic TnnT2 promotor, høj ekspression af GFP-genet i hjertet blev opnået. Derudover mål-mRNA blev inhiberet i hjertet, når en rAAV9-U6-shRNA blev anvendt. Arbejde viden om rAAV9 teknologi kan være nyttige for hjerte-kar-undersøgelser.
Controlling ekspression eller aktivitet af specifikke gener i forskellige biologiske systemer er blevet en værdifuld strategi i studiet af genfunktion 1. Et direkte middel til at opnå dette mål er at manipulere nukleotidsekvenser og generere mutant alleler. Selv lave præcise, målrettede ændringer til genomet af levende celler er stadig en tidskrævende og arbejdskrævende praksis, har udviklingen af de magtfulde Talen og CRISPR / Cas9 værktøjer åbnet en ny æra af genom-redigering 2-5. En mere rutine laboratorium metode til genmanipulation har fokuseret på at indføre genetisk materiale (DNA og RNA, som indeholder kodende sekvenser eller siRNA'erne / shRNAs) ind i cellerne til at udtrykke eller knockdown genet (r) af interesse 1,6.
I mange tilfælde, de store hindringer for genmanipulation er levering af DNA, RNA eller protein i cellerne. Med hensyn til in vitro studier, effektiv transfectipå systemer er blevet etableret i mange dyrkede cellelinier. Men i musemodellen især in vivo genlevering er mere udfordrende. Der er en serie af ekstra- og intracellulære barrierer, der skal udkobles for at opnå en effektiv cellulær optagelse af de eksogene reagenser. Yderligere hindringer omfatter den hurtige clearance og den korte varighed af den leverede materialer 7,8. En strategi til at omgå disse problemer er at anvende virusvektorer som "bærere" eller "vehikler" til in vivo-genadministration. De naturligt udviklede transduktion egenskaber vira tillader effektiv levering af et gen af interesse i celler 7,9,10. Talrige typer af virale vektorer er blevet udviklet og muliggøre fleksibel in vivo genmanipulation i forskellige celletyper og organer i mus.
De mest almindeligt anvendte virale systemer indbefatter retrovirus, lentivirus, adenovirus og adeno-associeret virus (AAV) <sop> 11. Retrovira er enkeltstrengede RNA-vira og kan introducere deres genetiske materiale til værtscellegenomet på stabil måde under mitotisk deling, hvilket giver potentiale for livslang ekspression af de transducerede gener i målcellerne og organer 12-14. Men mange typer af retrovira kun inficere delende celler, og deres effektivitet i ikke-delende celler er meget lav 15. Dette begrænser deres anvendelighed til gen-levering. Lentivirus er en slægt af Retroviridae familien. Forskellige fra andre retrovira, kan lentivirus inficere både delende og ikke-delende celler og har været meget anvendt til genoverførsel til post-mitotiske og højt differentierede celler 16. Livscyklus lentivirus involverer også integrationen af vektor-DNA i værtsgenomet. Således lentivirus-medieret genlevering muliggør stabil og langvarig ekspression af de transducerede genetiske elementer 16-18. Imidlertid kan denne funktion repræsenterer en dobbelt-edged sværd i brugen af disse vira til at manipulere genekspressionen, som integration af vektor-DNA kan føre til insertionsmutagenese i værtscellerne og kan forårsage kulturgenstandsspor virkninger. Adenovirus er en anden udbredt gentildelingssystem. I modsætning retrovira og lentivirus, adenovirus er ikke-integreret og ikke forstyrrer det genomiske integritet værtsceller 8,10,11,19. Desuden kan Adenovira transficere DNA i mange celletyper, og infektion er ikke afhængig af aktiv celledeling 19. En anden vigtig egenskab ved Adenovira er den lethed af vektor oprensning som de virale vektorer har evnen til at blive gentaget 19,20. , De store forbehold ved dette system er, at adenovirus infektion kan udløse kraftige immunreaktioner i target celler og organer 19, der begrænser dens anvendelse i mange undersøgelser, især i genterapi undersøgelser.
Sammenlignet med disse anden types af virale vektorer, rekombinant Adenoassocieret virus (rAAV) synes at være den ideelle gentildelingssystem 21,22. Det udstiller minimal immunogenicitet og patogenicitet 23,24. Desuden rAAV inficerer en bred vifte af celletyper, herunder både delende og ikke-delende celler. I de fleste tilfælde har rAAV ikke integreres i værts-genomer; således, at risikoen for uønskede genetiske eller genomiske ændringer i målcellerne er lav 22.
For nylig er rAAV-systemer succes blevet brugt til in vivo levering af DNA, der koder proteiner, miRNA, shRNAs, og CRISPR-gRNAs i muse hjertemuskel 23,25-29. Denne metode har lettet fundamentale undersøgelser og genterapi undersøgelser inden for hjerte-kar-forskning. Her til den detaljerede procedure generere rAAV9 vektorer der effektivt overekspression eller knockdown generne af interesse i mus hjerter blev beskrevet. Protokollen giver en enkel og effektiv metode tilmanipulere kardial genekspression i murine forsøgsmodeller.
Det er vigtigt at minimere uønsket ITR rekombination under plasmidkonstruktion. Før generering viruset, skal man altid overvåge ITR integritet AAV plasmider ved hjælp restriktionsfordøjelse og agarosegelelektroforese. Det er umuligt at opnå 100% intakte plasmider, men rekombinationen forholdet bør minimeres så meget som muligt. Mindre end 20% er acceptabel for en vellykket rAAV9 emballage. Af note, kan dyrkning af bakterierne ved lavere temperatur (30 ° C) med en lavere rystehastighed (180-200 rpm) reducere ris…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |