Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
मॉडल जीवों के व्यवस्थित उत्परिवर्ती संग्रह की प्ररूपी लक्षण वर्णन सेलुलर जटिलता विदारक के लिए एक सिद्ध दृष्टिकोण है। अगुणित कोशिकीय हरी शैवाल Chlamydomonas reinhardtii एक संयंत्र की तरह जीन सेट है, लेकिन यह भूमि संयंत्र 2 वंश में कई जीनोम दोहराव से पहले भूमि पौधों से अलग हुए। सिद्धांत रूप में, जीन दोहराव और एक मुख्य रूप से अगुणित जीवन चक्र की कमी बहुत हानि के समारोह आनुवंशिक दृष्टिकोण की सुविधा। हालांकि, ब्याज की जीन की लक्षित व्यवधान कुशल मुताबिक़ जीनोमिक एकीकरण की कमी के कारण लगभग असंभव है। एक यादृच्छिक इन्सर्शनल व्यवधान पुस्तकालय का निर्माण किया जा रहा है, बाधित साइट की पहचान के साथ संयुक्त, अब तक 1935 मैप किया 1,562 जीन 3 का प्रतिनिधित्व करने वाले अवरोधों का एक arrayed सेट उपज। हालांकि, इस दृष्टिकोण (सामान्य में उम्मीद अशक्त म्यूटेशन का उत्पादन करने के लिए) आवश्यक जीनों के लिए लागू नहीं है। तापमान के प्रति संवेदनशील (टीएस) म्यूटेशन recovere जा सकती हैआवश्यक जीन में डी, और हाल के तरीकों उत्परिवर्तित जीन और प्रेरणा का घाव के कुशल पहचान देते हैं। उच्च तापमान पर प्ररूपी विश्लेषण तो उत्परिवर्तित जीन के समारोह के बारे में तत्काल जानकारी प्रदान करता है। हम अलगाव और ~ 70 Chlamydomonas में आवश्यक जीन में म्यूटेशन टीएस घातक के लक्षण वर्णन पर सूचना दी, कोशिका चक्र प्रगति में शामिल जीनों पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित है और 1,4 नियंत्रित करते हैं।
टीएस घातक स्क्रीन दशकों 5,6 के लिए सूक्ष्मजीवों में आनुवांशिक विश्लेषण का एक मुख्य आधार किया गया है। सिद्धांत रूप में, एक वांछनीय विशेषता "संतृप्ति," जिसका अर्थ है कि सभी मारक टीएस करने के लिए परिवर्तनशील में सक्षम जीन, कम से कम एक उत्परिवर्ती द्वारा पहचाने जाते हैं एक पूरा विश्लेषण की अनुमति दृष्टिकोण है। हालाँकि, व्यवहार में, कई कारकों संतृप्ति के लिए दृष्टिकोण की सीमा। सबसे पहले, जबकि लगभग सभी जीनों उच्च तापमान पर गतिविधि के नुकसान के लिए उत्परिवर्तित जा सकता है, इस तरह के म्यूटेंट की वसूली की दक्षता भर में कम से कम बदलता हैपरिमाण 7.8 के एक आदेश। इसलिए, एक यादृच्छिक स्क्रीन "अक्सर यात्रियों" लंबे समय से पहले संतृप्ति संपर्क किया है में आवर्तक हिट लेने के लिए शुरू होता है। दूसरा, जबकि टीएस म्यूटेशन आमतौर पर समारोह की कमी का परिणाम है, वे नहीं एक प्रतिबंधक तापमान पर सच nulls हो सकता है (इसके विपरीत और, अक्सर एक अनुमोदक के तापमान पर पूरी तरह से कार्य नहीं कर रहे हैं)। यह समस्या कई alleles की तुलना द्वारा कुछ हद तक निपटा जा सकता; अगर वे सब एक आम लक्षण प्रारूप का हिस्सा है, यह अधिक जीन की साधारण निष्क्रियता का परिणाम को प्रतिबिंबित करने की संभावना है। एकाधिक alleles भी प्रेरणा का घाव 1 की निश्चित आणविक पहचान के लिए बहुत उपयोगी हैं। हालांकि, "लगातार उड़ाका" समस्या का मतलब शायद ही कभी मारा जीन में कई alleles ठीक करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
इन कारणों के लिए, हम अलग और phenotypically टीएस म्यूटेंट को चिह्नित करने के लिए एक बढ़ाया पाइप लाइन विकसित किया गया है। हम 3,000 से अधिक टीएस म्यूटेंट एकत्र किया है अब तक, मैंके बारे में 200 नए उम्मीदवार कोशिका चक्र म्यूटेशन ncluding। इस संग्रह है, जो पहले से ही होने की संभावना सबसे अधिक या सभी सेल आवश्यक रास्ते में परिवर्तन भी शामिल है, की आणविक और प्ररूपी विश्लेषण संयंत्र कोशिका जीव विज्ञान में नए अंतर्दृष्टि और परिकल्पना प्रदान करना चाहिए। महत्वपूर्ण बात, इस पाइप लाइन के किसी भी सूक्ष्मजीव कि अगर पर बढ़ता कुशलता टीएस उत्परिवर्ती संग्रह का निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है।
उपकरण पर ध्यान दें: दो रोबोटों इस प्रक्रिया (एक कॉलोनी बीनने और एक संयोजन प्रतिकृति plater / चेरी बीनने) में दक्षता के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। Pickers आम तौर पर धातु पिन है। उठाया कालोनियों कुछ अवधि के लिए इन पिन पर हवा में आयोजित की जाती हैं (मिनट के लिए सेकंड, मॉडल पर निर्भर करता है)। Chlamydomonas हवा में एक धातु पिन पर के बारे में 20 सेकंड में मर जाता है। इस जीव के लिए मॉडल पसंद प्रतिबंधित। सटीकता मायने रखती है। हमारी कॉलोनी बीनने हद तक सही है; हालांकि, यह अपनी कार्रवाई में कुछ हद तक हिंसक है और स्प्रे आधारित पार संदूषण के लिए कुछ संभावना है। यह उच्च पर इस्तेमाल नहीं किया हैएर से 384 घनत्व (4.5 मिमी केंद्र-केंद्र रिक्ति); इस घनत्व, सटीकता पूरी तरह से स्वीकार्य है। प्रतिकृति चढ़ाना / चेरी उठा रोबोट (विभिन्न इन अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल संलग्नक) उठा पर बहुत धीमी है, लेकिन 1,536 घनत्व के लिए काफी सटीक (6,144 एक चुनौती है, यहां तक कि यह बहुत ही सटीक रोबोट के लिए है, हम इस घनत्व का मूल्यांकन किया लेकिन नहीं चुने गए हैं इसकी वजह यह अपने विभिन्न कठिनाइयों का उपयोग करने के लिए)। रोबोट में अच्छी तरह से काम नहीं करेंगे, तो प्लेटें, असमान लोड कर रहे हैं आदि। यह यकीन है कि सही बातें हो रही हैं होने की स्पॉट जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है; बेशक, रोबोट पहुंच से बाहर चला जाएगा और सामान्य में, सब कुछ ठीक है, तो पहले कुछ प्लेटों सही थे जाना होगा।
पाइपलाइन यहाँ टीएस घातक म्यूटेंट के उच्च उपज अलगाव के लिए वर्णित है कि Chlamydomonas जीनोम का संभवतः सभी सेलुलर जरूरी रास्ते प्रतिनिधित्व कर रहे हैं सुनिश्चित करता है। दो संभावित सेल चक्र जीन की कुशल संग्रह के लिए और दोहराव "लगातार उड़ाका" alleles के उन्मूलन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: अधूरा सेल चक्र और 2) पहले से ही पहचान के खिलाफ समानांतर पूरक परख के लिए गिरफ्तारी phenotype विशेषताओं का 1) सुसंगत परिभाषा जीन क्वेरी नव पृथक लोगों के साथ संग्रह विस्तार करने के लिए।
जब प्रकाश अंधेरे चक्र से सिंक्रनाइज़, Chlamydomonas किसी भी डीएनए प्रतिकृति या कोशिका विभाजन के 13 दिन के उजाले घंटे के बिना और सेल आकार> 10x में वृद्धि के दौरान photosynthetically बढ़ता है। लगभग रात की शुरुआत के साथ संपाती, कोशिकाओं तो डीएनए प्रतिकृति, बँटवारा, और कोशिका विभाजन (8 चित्रा) बारी से कई चक्र से गुजरना। यह नियामक schemई मुख्य रूप से कोशिकाओं के विकास और अखंडता और कोशिका विभाजन चक्र के लिए विशेष रूप से आवश्यक जीन के लिए आवश्यक जीन के बीच एक प्राकृतिक गौरव प्रदान करता है। हमने पाया है 10 घंटा और 20 घंटे की समय अंक बहुत जानकारीपूर्ण के लिए एक प्रारंभिक किसी न किसी प्ररूपी में कटौती कर रहे हैं 1 कि। टीएस घातक म्यूटेंट कि हम वर्तमान में पहचानते हैं, इन छवियों के आधार पर व्यापक वर्गों 1 (Tulin और क्रॉस, 2014 में एसआई देखें), कर रहे हैं: पायदान, पॉपकॉर्न, गोल, लघु, मध्यम, जल्दी सेल, और कई चक्र (8 चित्रा )।
तीन सबसे प्रासंगिक श्रेणियों हम पर ध्यान केंद्रित पायदान, पॉपकॉर्न, और गोल कर रहे हैं। "पायदान" और "पॉपकॉर्न" phenotypes सबसे सेल चक्र विशेष घावों की विशेषता होने के लिए पहले से दिखाया गया है (जैसे, mitotic cyclin निर्भर kinase, डीएनए प्रतिकृति मशीनरी, और topoisomerase द्वितीय) 1। एक (पायदान) या एकाधिक की उपस्थिति (पॉपकॉर्न) प्रारंभिक लेकिन असफल कोशिका विभाजन की स्पष्ट विमानों एक सुविधाजनक morphol हैसेल चक्र दीक्षा के ogical सूचक। इन म्यूटेंट आम तौर पर बहुत कम या कोई विकास दोषों का प्रदर्शन, 10 घंटे की निशान पर गुम्मट के समान सेल की मात्रा में वृद्धि के साथ। पायदान और पॉपकॉर्न phenotypes 10 घंटा में स्पष्ट कर रहे हैं और पूरी तरह से (अक्सर सेल के साथ जुड़े) विकसित कर रहे हैं 20 घंटा के द्वारा। "दौर" कोशिकाओं गुम्मट के लिए, लेकिन स्पष्ट प्रारंभिक विभाजन विमानों का बहुत कम उत्पादन के साथ इसी तरह से बढ़ती है, इस प्रकार बड़े, गोल गिरफ्तार कोशिकाओं से बेदखल। इस श्रेणी में पिछला म्यूटेंट microtubule समारोह (tubulin-तह सहकारकों, गामा ट्यूबिलिन अंगूठी जटिल) 1 के लिए आवश्यक anaphase को बढ़ावा देने के जटिल 14 या में जीन के घटकों में गिर गया है। बाद में समय में, इन कोशिकाओं को अक्सर स्पष्ट सेल दिखा रहे हैं।
"छोटे" और "मध्यम" कोशिकाओं या तो negligibly (छोटा) या काफी कम हो जाना डब्ल्यूटी (मध्यम) से अधिक है। इन म्यूटेंट तिथि करने के लिए पहचान की कई जीनों जिसका एनोटेशन बुनियादी cellula में भूमिका का सुझाव में घावों हैआर विकास प्रक्रियाओं (अनुवाद या झिल्ली biogenesis)। (:;: कम माध्यम गुम्मट की तरह गोल) मध्यम और दौर के बीच मुख्य सूक्ष्म भेदभाव 10 घंटा में विकास की राशि पर टिकी हुई है। क्योंकि छोटे और मध्यम श्रेणी के लिए काफी बड़े हैं और शायद सेलुलर रास्ते की एक बड़ी रेंज में घावों प्रतिबिंबित करती हैं, हम इन श्रेणियों तर करने के लिए प्रयास नहीं कर रहे हैं; हालांकि, हम वर्ग के प्रतिनिधियों की पहचान विविध रास्ते में नुकसान के phenotypes समझने के लिए molecularly करना चाहते हैं। दो अशिक्षित श्रेणियां हैं: 1) जल्दी-lysing म्यूटेंट कि पहले सेल के विकास के कुछ सबूत और 2) कई चक्र के साथ 10 घंटे की निशान से अखंडता खोना (हरे रंग की हानि, refractility की हानि)। कोशिकाओं को इसी तरह पैदा करना 10 और 20 घंटा पर गुम्मट, हालांकि वे लंबी अवधि के प्रसार के लिए बाहर ले जाने के लिए एक पूर्ण अक्षमता दिखा रहे हैं।
हम ज्यादातर "पायदान," "पॉपकॉर्न," और "दौर" निस्र्पक रहे हैं और बाहर निकालने के लिए छोटे और मध्यम दौर कोशिकाओं, के रूप में अच्छी तरह सेके रूप में टपका हुआ म्यूटेंट कि पूरा कुछ कोशिका विभाजन। यह सुनिश्चित करना है कि इस तरह के विकास और झिल्ली अखंडता, के रूप में बुनियादी सुविधाओं सेलुलर, कार्य कर रहे हैं और विभाजन से संबंधित जीन के लिए संभावना को समृद्ध करने के लिए मुख्य रूप से है। यह दृष्टिकोण अनुभव से कुशल हो पाया है; हालांकि, यह हो सकता है कि एक सेल चक्र जीन pleiotropic है और G1 में पहले अतिरिक्त भूमिका है, वास्तविक विभाजन से पहले। इस तरह के मामलों में, जो हम दुर्लभ होने की उम्मीद है, याद कर रहे हैं। आम तौर पर, हम समरूप गिरफ्तारी, जो उच्च संभावना में होने के कारण करने के लिए एक प्रेरणा का उत्परिवर्तन एक पूरी तरह से बेकार प्रोटीन होता है वह यह है कि के लिए लक्ष्य। हालांकि, एक ही कारण के रूप में सिर्फ वर्णित के लिए, वहाँ कई गिरफ्तारी अंक हो सकता है और इसलिए, कुछ लचीलापन उम्मीदवारों के चयन में सलाह दी जाती है।
आदेश नव पहचान जीन के साथ संग्रह को समृद्ध करने के लिए, चुने हुए उम्मीदवारों पूरक के लिए यत्न कर रहे हैं। हम सकारात्मक नियंत्रण में ts- आवश्यकता नकारात्मक नियंत्रण में (क्वेरी उत्परिवर्तन के खिलाफ क्वेरी) और टीएस + (Querगुम्मट के खिलाफ y)। क्वेरी के रूप में एक ही पूरक समूह में नई म्यूटेंट ts- हैं। एक ही पूरक समूह में सदस्यता लगभग हमेशा एक ही जीन में एक आणविक घाव (इस तरह के हर जीन हम परीक्षण किया है के लिए मुकदमा किया गया है) को दर्शाता है। इसलिए, के लिए "अक्सर यात्रियों," इस कसौटी आगे लक्षण वर्णन के लिए अपवर्जनात्मक है। म्यूटेंट कि परीक्षण प्रश्नों के रूप में एक ही पूरक समूहों पर नहीं थे नए जीन के लिए उम्मीदवार हैं और आगे जैव सूचना विज्ञान और प्रायोगिक उपकरणों की विशेषता है। अलग-अलग समूहों में पूरक ts- alleles की अत्यधिक चर वसूली एक प्रसिद्ध घटना है कि है, परिवर्तनशीलता mutability विभिन्न जीनों के बीच ts- के महान आंतरिक परिवर्तनशीलता के कारण, पॉसों शोर से स्पष्ट रूप से अधिक है। आंतरिक मतभेद thermolability शामिल हो सकते हैं कारण बनता है; विभिन्न आकारों प्रोटीन; एक मोनोमर बनाम एक बड़े रूप में, जटिल स्थिर रूप में एक प्रोटीन की उपस्थिति; और mutagenic हॉट स्पॉट। यह लगभग एक शुद्ध nuisa हैnce। हालांकि, एक परिणामस्वरूप अनुकूल परिणाम है कि "लगातार उड़ाका" सूची (सूची के सबसे कब्जे में केवल कुछ ही लक्ष्य के साथ) लंबा नहीं है, इसलिए श्रम प्रधान पूरक परीक्षण परियोजना के बाद के चरणों में जब तक एक विशाल उपक्रम नहीं है।
एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम एक कड़ी परख प्रदर्शन किया। इस परख में, डबल-प्रतिरोधी संततियों चुने गए हैं और ts- phenotype के लिए परीक्षण कर रहे हैं। एक ts- phenotype की उम्मीद (और कहा) क्वेरी के रूप में या कसकर जुड़े म्यूटेशन के लिए एक ही पूरक समूह में म्यूटेंट के लिए किया जाता है। परीक्षण किया जीनों में से प्रत्येक के लिए, एक गुम्मट संतान (टीएस + phenotype) आनुवंशिक दूरी के आधार पर एक निश्चित संभावना में प्रदर्शित होने की उम्मीद है। हम अनुमान है इन स्थानों में प्रत्येक संभोग के लिए करीब 100 zygospores देखते हैं कि। 100% meiotic दक्षता मान लिया जाये, इस एम के कारण लिंक रद्द दवा प्रतिरोध कैसेट से करीब 100 डबल-दवा प्रतिरोधी संतान (meiotic संतान के 25%, चार अर्धसूत्रीविभाजन प्रति, में परिणाम होगाendelian विरासत)। यह भी ts- म्यूटेशन, जहां संततियों के 25% डबल उत्परिवर्ती हो जाएगा के लिए इस मामले की जाएगी, और 25% WT होगा अगर क्वेरी और परीक्षण म्यूटेशन लिंक रद्द कर रहे हैं। इसलिए, डबल-दवा प्रतिरोधी संतान से बाहर, 25% डब्ल्यूटी (लगभग 25 कोशिकाओं) हो जाएगा। यह पूरी तरह से अनलिंक म्यूटेशन के लिए मामला है; हालांकि, मध्यम उठाना (~ 20 सेमी, के बारे में 2 एमबी, या जीनोम 115 के 2% के भीतर) दृढ़ता से कम या टीएस + संकेत को समाप्त होगा। एंटीबायोटिक कैसेट करने के लिए परीक्षण उत्परिवर्तन के संबंध के मामले में, टीएस + haploids कि डबल-दवा-प्रतिरोधी रहे हैं बहुत ही कम मात्रा में मौजूद हैं। यह पूरक सभी म्यूटेंट परीक्षण किया है, एक न्यायपालिका परिणाम है कि आसानी से उल्लेख किया, बावजूद परीक्षण सभी म्यूटेंट के साथ recombine को स्पष्ट विफलता के रूप में प्रकट होता है; ऐसे मामलों में, backcrossing समस्या का समाधान होगा।
पूर्व ज्ञान से और अनुक्रम विश्लेषण से दोनों में, हम Chlamydomonas में सेल चक्र जीन लगभग 500 जीनों 2 होने की उम्मीद है, हालांकि मोअनुसूचित जनजाति, लेकिन शायद सभी नहीं, जरूरी है। हम अतिरिक्त म्युटाजेनेसिस राउंड के लिए आवश्यकता के रूप में अधिक म्यूटेंट एकत्र कर रहे हैं और संतृप्ति उगता के स्तर का मूल्यांकन करेंगे।
इस प्रक्रिया के अनोखे आवश्यक जैविक प्रक्रियाओं और जीन और प्रोटीन है कि उन्हें ले जाने के लिए बाहर के अध्ययन के लिए बनाया गया है। अन्य तरीके उत्पन्न करने के लिए आवश्यक जीन में अव्यवस्थाएं मौजूद हैं (जैसे, बेतरतीब ढंग से mutagenized alleles 16, सशर्त लिखित alleles 17, या hypomorphic alleles 18 के परिवर्तन)। हालांकि, वे सभी मुताबिक़ पुनर्संयोजन, जो दृढ़ता से वनस्पति Chlamydomonas में दबा दिया जाता है की आवश्यकता होती है। क्लस्टर, नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराने (CRISPR) / Cas9 प्रणाली जीन संशोधन 19 के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है; हालांकि, यह अभी तक Chlamydomonas 20 में कुशलता से काम करने के लिए है। गंभीर, इन तरीकों में से सभी लक्ष्य के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता होती है। यह एक गंभीर प्रतिबंध हैएक संभावना यह कुछ नया सीखने के लिए है करने के लिए चाहता है! हमारा दृष्टिकोण आवश्यक जीन, किसी भी पूर्व ज्ञान की स्वतंत्र पहचान के म्यूटेशन निकलेगा। इसलिए, प्रौद्योगिकी के वर्तमान स्तर पर, गहरी अनुक्रमण द्वारा जीन की पहचान के द्वारा पीछा यादृच्छिक टीएस म्यूटेशन के अलगाव संयंत्र superkingdom में माइक्रोबियल कोशिका जीव विज्ञान में तेजी से प्रवेश पाने का सबसे कारगर तरीका हो सकता है।
प्रेरणा का म्यूटेशन की पहचान (से ~ 100 के बीच कोडिंग-अनुक्रम बदलते प्रत्येक क्लोन में म्यूटेशन) इस पत्र के दायरे से परे है। Bulked segregant पूल 1 की गहरी अनुक्रमण प्रभावी लेकिन श्रम प्रधान है। उपभेदों की एक बड़ी संख्या में सभी म्यूटेशन के निर्धारण के लिए एक मिश्रित पूल रणनीति, पूल की एक छोटी संख्या अनुक्रमण के बाद, बहुत लागत और श्रम प्रभावी है। मिश्रित bulked segregant अनुक्रमण के लिए एक नई रणनीति के विकास के अंतर्गत है कि सिम म्यूटेंट के दर्जनों में प्रेरणा का म्यूटेशन की पहचान के लिए अनुमति देगाएक भी अनुक्रमण रन (तैयारी में) में ultaneously। इन क्षमता महत्वपूर्ण जीन की पहचान कदम म्यूटेंट कि यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं द्वारा ही संभव बनाया है बहुत तेजी से संचय के साथ तालमेल रखने के लिए अनुमति देने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम सलाह और उपयोगी चर्चा के लिए क्रॉस प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद। इस काम PHS 5RO1-GM078153 द्वारा और द्वारा समर्थित किया गया सिमंस फाउंडेशन मीकल Breker करने से एक जूनियर फेलो अवार्ड।
Equipment: | |||
Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |