Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
Fenotypisk karakterisering av systematiska muterade samlingar av modellorganismer är en beprövad metod för att dissekera cellulär komplexitet. Den haploida encelliga grönalger Chlamydomonas reinhardtii har en anläggning liknande genuppsättning, men det skilde sig från landväxter innan flera genomdubbel i landet växt härstamning 2. I princip avsaknad av genduplikation och en huvudsakligen haploid livscykel underlättar i hög grad förlust av funktions genetiska metoder. Det är dock nästan omöjligt riktade störningar av gener av intresse på grund av bristen på effektiv homolog genomisk integration. Ett slumpmässigt inser avbrott bibliotek är under konstruktion, i kombination med identifiering av den avbrutna platsen hittills ger en klädd uppsättning av 1,935 mappade störningar representerar 1,562 gener 3. Emellertid är detta tillvägagångssätt (förväntas i allmänhet att producera null mutationer) inte tillämplig på essentiella gener. Temperaturkänsliga (ts) mutationer kan recovered i essentiella gener, och de senaste metoderna möjliggöra en effektiv identifiering av den muterade genen och orsakande skada. Fenotypisk analys vid hög temperatur ger sedan omedelbar information om funktionen av den muterade genen. Vi rapporterade om isolering och karakterisering av ts letala mutationer i ~ 70 essentiella gener i Chlamydomonas, med särskilt fokus på gener som är involverade i cellcykelprogression och kontrollerar 1,4.
Ts dödliga skärmar har varit en stöttepelare i genetisk analys i mikroorganismer i årtionden 5,6. I princip är en önskvärd egenskap att närma sig "mättnad", vilket innebär att alla gener kan mutera till TS dödlighet identifieras genom åtminstone en mutant, vilket gör att en fullständig analys. Men i praktiken, flera faktorer begränsar det tillvägagångssätt till mättnad. Först, medan nästan alla gener kan muteras till förlust av aktivitet vid hög temperatur, effektiviteten i utvinning av sådana mutanter varierar över åtminstoneen storleksordning 7,8. Därför börjar en slumpmässig skärm, för att plocka upp återkommande träffar i "frekventa" långt innan mättnad närmar sig. För det andra, medan ts mutationer resulterar vanligen i en minskning av funktion, kan de inte vara sanna nollor vid en restriktiv temperatur (och omvänt, är ofta inte fullt fungerande vid en tillåten temperatur). kan behandlas problemet med till viss del genom att jämföra flera alleler; om de alla har en gemensam fenotyp, är detta mer sannolikt att återspegla resultatet av enkel inaktivering av genen. Flera alleler är också till stor hjälp för definitiv molekylär identifiering av orsakande skada en. Men betyder "frequent flyer" problem att flera alleler i sällan drabbade gener kan vara svårt att återhämta sig.
Av dessa skäl har vi utvecklat en förbättrad rörledning för att isolera och fenotypiskt karakterisera ts mutanter. Vi har samlat över 3000 ts mutanter Hittills har jagncluding ca 200 nya kandidatcellcykel mutationer. Molekylär och fenotypisk analys av denna samling, som redan sannolikt innehåller mutationer i de flesta eller alla cell väsentliga vägar bör ge nya insikter och hypoteser i växt cellbiologi. Viktigt, kan denna rörledning tillämpas på alla mikroorganism som växer på agar för att effektivt konstruera ts muterade samlingar.
En notering om utrustning: två robotar är mycket viktiga för effektiviteten i detta förfarande (en koloni väljare och en kombination replik plater / skylift). Plockare har typiskt metallstift. Plockade kolonier hålls i luften på dessa stift för en period (sekunder till minuter, beroende på modell). Chlamydomonas dör i ungefär 20 sekunder på ett metallstift i luften. Detta begränsar modell val för organismen. Noggrannhet frågor. Vår koloni väljare är någorlunda korrekt; Det är dock något våldsamt i sin talan och har viss möjlighet till sprutbaserad korskontaminering. Den används inte vid höger än 384 densitet (4,5 mm centrum mittpunkt); vid denna densitet, är noggrannheten helt acceptabelt. Repliken beläggning / körsbär plockrobot (olika tillbehör som används för dessa applikationer) är mycket långsammare vid plockning, men är tillräckligt exakt för 1536 densitet (6144 är en utmaning, även för denna mycket noggrann robot, vi har utvärderat denna densitet men valt att inte att använda det på grund av dess olika svårigheter). Roboten kommer inte att fungera bra om plattorna lastas ojämnt, osv. Det är viktigt att spot-kontrollera att vara säker på att rätt saker händer; Naturligtvis kommer roboten köra obevakad och i allmänhet, allt kommer att gå bra, om de första plattorna var korrekta.
Rörledningen som beskrivs här för hög avkastning isolering av ts dödliga mutanter säkerställer att förmodligen alla cellulära väsentliga vägar i Chlamydomonas genomet är representerade. De två mest kritiska steg för effektiv insamling av potentiella cellcykelgener och för eliminering av repetitiva "frequent flyer" alleler är: 1) sammanhängande definition av häktnings fenotyp egenskaper för ofullständiga cellcykler och 2) parallellkompletteringsanalys mot redan identifierade fråga gener för att förstora den samling med nyisolerade sådana.
När synkroniseras av ljus-mörker cykler, Chlamydomonas växer fotosyntetiskt under dagtid och ökningar i cellstorlek> 10x utan DNA-replikation eller celldelning 13. Ungefär sammanfaller med uppkomsten av natten, celler genomgår sedan flera cykler av omväxlande DNA-replikation, mitos och celldelning (Figur 8). Denna reglerings Scheme ger en naturlig skillnad mellan gener främst krävs för celltillväxt och integritet och gener som krävs specifikt för celldelningscykeln. Vi fann att 10-h och 20-h tidpunkter är mycket informativ för en första grov fenotypisk skära en. De breda klasser av ts dödliga mutanter som vi känner igen idag, baserat på dessa bilder (se SI i Tulin och Cross, 2014) 1, är: Notch, popcorn, runda, Small, Medium, tidig lys, och flera cykel (Figur 8 ).
De tre mest relevanta kategorier vi fokuserar på är Notch, popcorn, och runda. De "Notch" och "Popcorn" fenotyper visades tidigare vara kännetecknande för de flesta cellcykelspecifika lesioner (t.ex. mitotiskt cyklin-beroende kinas, DNA-replikation maskiner, och topoisomeras II) 1. Utseendet på en (Notch) eller flera (Popcorn) uppenbara plan begynnande men misslyckades celldelning är en bekväm Morphological indikator på cellcykel inledande. Dessa mutanter uppvisar i allmänhet liten eller ingen tillväxtrubbningar, med ökningar i cellvolym liknar WT vid 10-hr märket. Notch och popcorn fenotyper är uppenbara på 10 timmar och är fullt utvecklade (ofta förknippade med cellys) med 20 timmar. "Round" celler växer på samma sätt som WT men med mycket minskad produktion av uppenbara begynnande division plan, vilket ger stora, runda gripits celler. Tidigare mutanter i denna kategori har fallit i delar av Anafasa befrämjande komplex 14 eller i gener som krävs för mikrotubuli funktion (tubulin-vikning cofaktorer, gamma-tubulin ring komplex) 1. Vid senare tillfällen, dessa celler uppvisar ofta uttalad cellys.
"Small" och "Medium" celler växer antingen obetydligt (Small) eller betydligt mindre än WT (Medium). Många av dessa mutanter som hittills identifierats har lesioner i gener vars kommentarer tyder roller i grund ²cellula²r tillväxtprocesser (översättning eller membran biogenes). Den huvudsakliga mikroskopiska diskriminering mellan Medium och runda vilar på mängden tillväxt på 10 h (Round: som WT; Medium: reducerad). Eftersom små och medelstora kategorier är ganska stora och förmodligen återspeglar lesioner i ett stort utbud av cellulära vägar, är vi inte försöker att mätta dessa kategorier; Men vill vi molekylärt identifiera representanter för klassen att förstå fenotyper av förlust i olika vägar. Två unstudied kategorier är: 1) tidig lyse mutanter som förlorar integritet (förlust av grön färg, förlust av refractility) av 10-hr märket, med få tecken på tidigare celltillväxt och 2) de multipla cykler. Celler prolifererar på liknande sätt till WT vid 10 och 20 h, även om de uppvisar en fullständig oförmåga att utföra långsiktiga proliferationen.
Vi är oftast kännetecknar "hack", "popcorn" och "rund" och undanta små och medelstora runda celler, samtsom läckande mutanter som kompletta några celldelningar. Detta är främst att se till att de grundläggande cellulära funktioner, såsom tillväxt och membranintegritet, är funktionella och berika sannolikheten för division relaterade gener. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara empiriskt effektiv; Emellertid kan det vara så att en cellcykel gen är pleiotropa och har ytterligare roller tidigare i G1, innan själva division. Sådana fall, som vi räknar med att vara sällsynta, missas. Mer allmänt, strävar vi efter homogen stillestånd, som i hög sannolikhet beror på en orsakande mutation som är en helt dysfunktionella protein. Emellertid av samma skäl som just beskrivits, kan det finnas flera gripande punkter och därför är viss flexibilitet tillrådligt att välja kandidater.
För att berika samlingen med nyligen identifierade generna, är de utvalda kandidaterna analyserades för komplettering. Vi kräver TS- i den positiva kontrollen (fråga mot fråge mutation) och ts + i den negativa kontrollen (query mot WT). Nya mutanter i samma komplementegrupp som frågan är ts. Medlemskap i samma komplemente grupp nästan alltid avspeglar en molekylär skada i samma gen (detta har varit fallet för varje sådan gen vi har testat). Därför, för "frequent flyers" detta kriterium är utestängande för ytterligare karakterisering. Mutanter som inte var på samma komplemente grupper som de testade frågor är kandidater för nya gener och kännetecknas vidare av bioinformatik och experimentella verktyg. Mycket varierande återhämtning av TS- alleler i olika komplementegrupper är ett välkänt fenomen, det vill säga är markant större än Poisson buller variabilitet på grund av den stora inneboende variabilitet föränderlighet att TS- mellan olika gener. Orsaker kan omfatta inneboende thermolability skillnader; olika protein storlekar; närvaron av ett protein som en monomer kontra som en stor, stabiliserat komplex; och mutagena hot spots. Detta är nästan en ren nuisance. Men det är en följd positivt resultat att "frequent flyer" lista är inte lång (med endast ett fåtal mål som upptar större delen av listan), så den arbetsintensiva komplemente testning är inte en massiv företag tills de senare stadierna av projektet.
Som ett komplement, genomförde vi en länkanalys. I denna analys är dubbelresistenta avkommor valt och testas för TS- fenotypen. En TS- fenotyp förväntas (och observerade) för mutanter i samma komplementegrupp som frågan eller för tätt kopplade mutationer. För var och en av de testade gener, är en WT avkomma väntas dyka upp (ts + fenotyp) i en viss sannolikhet beroende på den genetiska avstånd. Vi uppskattar att det finns omkring 100 zygospores för varje parning i dessa fläckar. Förutsatt 100% meiotiska effektivitet, kommer detta att resultera i cirka 100 dubbel-resistent avkomma från länkade läkemedelsresistenskassetter (25% av den meiotiska avkomma, fyra per meios, tack vare Mendelian arv). Detta skulle också vara fallet för TS- mutationer, där 25% av avkommorna blir dubbel mutant, och 25% kommer att vara WT Om frågan och test mutationer är okopplade. Därför ut ur den dubbelläkemedelsresistenta avkomman, kommer 25% att vara WT (cirka 25 celler). Detta är fallet för helt länkade mutationer; dock måttlig koppling (inom ~ 20 cm, ca 2 Mb, eller 2% av genomet 115) kommer att kraftigt reducera eller eliminera ts + signalen. I fallet med koppling av den testade mutationen mot antibiotikan kassett, ts + haploider som är dubbelläkemedelsresistenta är närvarande i mycket små mängder. Detta yttrar sig som uppenbara misslyckande att rekombinera med alla mutanter som testats, trots att komplettera alla mutanter testas, en avvikande resultat som lätt noteras; i sådana fall kommer återkorsning lösa problemet.
Både från förkunskaper och från sekvensanalys, förväntar vi cellcykelgener i Chlamydomonas att vara cirka 500 gener 2, även om most, men troligen inte alla, är viktiga. Vi kommer att utvärdera behovet av ytterligare mutagenes rundor eftersom fler mutanter samlas in och graden av mättnads stiger.
Detta förfarande är unikt utformad för att studera grundläggande biologiska processer och gener och proteiner som utför dem. Andra metoder för att generera störningar i viktiga gener förekommer (t.ex. omvandling av slumpmässigt muterade alleler 16, villkorligt transkriberade alleler 17, eller hypomorphic alleler 18). Men de alla kräver homolog rekombination, som är starkt undertryckt i vegetativt Chlamydomonas. Den samlade regelbundet mellanrum kort palindrom upprepa (crispr) / Cas9-systemet har etablerats som ett kraftfullt verktyg för genmodifiering 19; Det är dock ännu att arbeta effektivt i Chlamydomonas 20. Kritiskt, alla dessa metoder kräver förkunskaper av målet. Detta är en allvarlig begränsningom man vill ha möjlighet att lära sig något nytt! Vår strategi kommer att ge mutationer som identifierar viktiga gener, oberoende av några förkunskaper. Därför på den nuvarande nivån på teknik, kan isolering av slumpvisa ts mutationer följt av genen identifiering genom djup sekvense vara den mest effektiva metoden för att få snabbt inträde i mikrobiell cellbiologi i anläggningen superkingdom.
Identifiering av orsakande mutationer (bland ~ 100 kodande sekvens förändrande mutationer i varje klon) är utanför ramen för denna uppsats. Djup sekvensering av bulkade segregant pooler 1 är effektiv men arbetskrävande. En kombinatorisk pool strategi för bestämning av alla mutationer i ett stort antal stammar, efter sekvensering av ett litet antal pooler, är mycket kostnads- och arbetseffektiv. En ny strategi för kombinatorisk bulk segregant sekvense är under utveckling som gör det möjligt att identifiera orsaks mutationer i dussintals mutanter simultaneously i en enda sekvenseringskörning (under utarbetande). Dessa effektivitetsvinster är mycket viktigt att ge den kritiska genen identifierings steg för att hålla jämna steg med den mycket snabba ackumuleringen av mutanter som möjliggörs genom de förfaranden som beskrivs här.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Cross lab medlemmar för att få råd och nyttig diskussion. Detta arbete stöddes av PHS 5RO1-GM078153 och en Junior Fellow utmärkelse från Simons Foundation till Michal Breker.
Equipment: | |||
Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |