Summary
אנו מציגים מודל השתלת אבי העורקים orthotopic בטכניקה שרוול בעכברים. זו שיטה השקה מהירה מאוד, אשר יכול להיות מועסק במחקרים של מחלת כלי דם.
Abstract
השתלת אב העורקים Orthotopic בטכניקה שרוול מפחית לפגיעה העורקים עם השלילי של 10-20% בלבד. הזמן anastomose העורקים בעכברים באמצעות השיטה שרוול היה קצר ולא קל ממוצע של 20 דקות, המתיר מחקרים שתלי iso/מאפשר. המאמר הבא מתאר את הליך השתלת אב העורקים בשימוש המעבדה שלנו. העכברים היו מרדימים עם תערובת של איזופלוריין נפח 1.5% ו 100% חמצן דרך מסיכת פנים. בשלב זה, הקטע של אבי העורקים בין העורקים הכליות שלו נגע הסתעפות הופרד מן הווריד הנבוב, בחופשיות מוכן clampedat מקטעי לקרע, בתפר משי יחיד. לפני ההסרה של אבי העורקים תמיסת מלח המכיל הפארין היה מוזרק הכלילי התחתון. לאחר מכן אבי העורקים נחתך בין התפסים, פתרון הפארין מלוחים שימש ריקון לומן. הטכניקה שרוול בתפרים monofilament שימשה על מנת להשתיל. העורק בתפקיד orthotopic.
Introduction
כפי ציינתי במחקר הקודם, תשומת לב רבה הוקדשה מודלים מאתר השתלת אב העורקים אשר מאפשרים אפליה בין תגובות ספציפיות בכלי הדם נגרמת על ידי השתל עצמו גורמים מערכתית מסוימים הקשורים סביבה arteriogenic 1 , 2 , 3. הגורם משחק כאן תפקיד מכריע הוא הזמינות של נוקאאוט, העכברים הטרנסגניים. מעורבותם במודל כזה מציע את האפשרות של זיהוי וקביעת משעולים pathophysiological חדשים הקשורים להתפתחות מחלות כלי דם ניווניות, כגון טרשת עורקים, מפרצת היווצרות4, 5.
ראוי לציין כי במהלך הרכבה של איסכמיה/פגיעה reperfusion מהותי לפגיעה בכלי הדם המיועדים להשתלה עשויים להופיע. לכן, המופע של בעיות ספציפיות עם שתל שלמות או לתגובה דלקתית לא צפויה במהלך התקופה שלאחר הניתוח לא ייכללו אולי מסלק שינויים הקשורים pathophysiological ניווניות מחלות לב וכלי דם3 ,4,5,6,7. שרוול השקה היא שיטת קצה-ב חלופי עורקי השקה של כלי בקוטר של פחות מ 1 מילימטר, הוחל בהצלחה בכליות, לב השתלת בחולדות הותאמה לאחר מכן אבי העורקים השתלת בעכברים על ידי. Dambrin et al. 8 , 9 , 10 , 11.
אבי העורקים נזק בטכניקה השתלת שרוול ממוזער, בקצב נמוך מאוד כשל טכני, עקב זה שנמשך רק 20 דקות בממוצע. התוצאות הקודמות שלנו הראו מאפיינים מבניים פונקציונלי מעולה של isograft של ויוו לאחר ההשתלה באמצעות טכניקה שרוול1. . Dambrin et al. לתאר את זה אחרי עקומת לימוד קצרה שיעור ההצלחה היה מעל 78%10. סיבוכים כגון פקקת הם נדירים, לדוגמה Engelbrecht. et al. לא להתבונן פקקת בטכניקה שרוול ב השתלת כליות עכברוש8.
המודל מאתר השתלת אב העורקים עם שרוול. חיבור הוא כלי מהיר וקל ללמוד iso/להשתלת בתגובות הכלי המושתלים. וידאו זה מדגים את הליך השתלת אב העורקים מתבצעת במעבדה שלנו. מודל זה השתלת עשויה להועיל בהגדרת המנגנונים פתולוגיים הבסיסית של כלי דם מחלות ניווניות, עשוי לתרום הערכה נוספת של התערבויות תרופתי המולקולריים12.
Protocol
הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב RWTH מאוניברסיטת אאכן, AZ 84-02.04.2012.A234.
הערה: ההליך הוכח שימוש בעכברים בוגרים זכר פראי סוג CD1 רקע. לשמור על העכברים ביחידת המעבדה המקצועית לפני ואחרי הניתוח, שמבטיח גישה מתאימה מזון, ביקורת וטרינרית המקצועית של הטיפול. אם בעלי החיים הם רכשו מכל בחוץ, לאפשר הסתגלות שבוע לפני ביצוע הניתוח.
1. הכנה של התורם
- להשתמש מכשירים וחומרים סטרילי כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח כדי למנוע זיהומים.
- עזים ומתנגד לכל העכבר בתערובת של 1.5% על-ידי אחסון איזופלוריין ו 100% חמצן דרך מסיכת פנים. הנח העכבר על פלטפורמה נמצא במצב פרקדן הקלטת כל הרגליים שלה על שולחן הניתוחים. בדוק את הרפלקסים שלו על ידי צובט את הרגליים האחוריות כדי להיות בטוח כי העכבר. הוא מורדם במידה מספקת. במקום אופטלמולוגיות משחה על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ההליך.
- להסיר שיער כל הבטן בעזרת ג'ל depilatory או להשתמש של מכונת הגילוח. לבצע את הפעולה בתנאים סטריליים. לחטא את הבטן עם מתחלפים קרצוף של chlorhexidine ובמים סטריליים.
- להסיר את העורקים התורם דרך חתך בבטן קו האמצע עם מספריים או סכין. משכי את המעי באופן ידני מימין. בעדינות ידנית לשקף את המעיים מעל לצד באמצעות אבקה כפפות בחינם.
- למקם את המעי על פיסת גזה שנרטבו עם תמיסת מלח כדי לשמור על לחות.
- לנתח משם. העורק בזהירות רבה מן הרקמה שמסביב באמצעות ניתוח בוטה עם פינצטה.
- נפרדים על הקטע של אבי העורקים בין העורקים הכליות שלו נגע הסתעפות של הווריד הנבוב עם פינצטה.
- מאובטח בכל ענפי קטע זה מאוד בזהירות באמצעות 11-0 monofilament יחידה תפר קטן.
- לפני הסרת אבי העורקים, להזריק 0.5 מיליליטר (מ"ל) תמיסת מלח המכיל 50 U של הפארין לתוך הכלילי התחתון.
- תן החיה תורם תדמם לאחר הסרת על הקטע של אבי העורקים.
- לשטוף את השתל באופן מלא עם תמיסת מלח ולאחר מכן להעביר אותו מיד אל גורם מכיל של תמיסת מלח קרה כקרח.
2. הכנה של הנמען
- עזים ומתנגד החיה הנמען בתערובת של 1.5% על-ידי אחסון איזופלוריין ו 100% חמצן דרך מסיכת פנים, ולאחר מכן להסיר את השיער ולחטא (סעיף 1). עושים חתך קו אמצע מ מצאתי על האגן עם איזמל ומשכו את הקירות בטן. במקום אופטלמולוגיות משחה על העיניים למניעת יובש במהלך ההליך.
- גלישת המעי הגס בתמיסת לחלח גזה, תחסיר בעדינות לחיה ' צודקת.
- Dissect העורקים מתחת לכליות חינם בין העורקים כליות הציר הקרוב, ההסתעפות רחוק עם פינצטה.
- מאובטח בכל ענפי קטע זה מאוד בזהירות באמצעות 11-0 monofilament יחידה תפר קטן.
- תהדק את החלקים הפרוקסימלית ו דיסטלי של אבי העורקים בתפר משי יחידה 6-0-
- לחלק את העורקים באמצע בין התפסים, להרוות את הקצוות לחתוך עם מלוחים heparinized ריקון הפתוח לומן.
- למקם את השתל המיקום orthotopic עם תום כלי האכלה לתוך כלי המקבל ואחריו תפירת עם 11-0 monofilament מקפיד להימנע כל פיתול של אבי העורקים על ידי יישור כראוי את התורם ואת (נמענים איור 1) 10.
- בקפידה לשחרר את ליגטורות לאחר חקירה של ההשקה. לשחרר את המלחציים דיסטלי קודם. התוצאה היא לחץ נמוך מחזיק הקירות יחד לפני שחרור הצד בלחץ גבוה הפרוקסימלית.
- Perfuse השתל מיד, תבדוק את הדופק גלוי. הסר בעדינות את שרידי המשי. האורך האופטימלי חפיפה בין התורם העורקים הנמען הוא 1-2 מ מ.
- להחזיר את תוכן הבטן אל חלל הבטן ולסגור את כל פצע רץ 3-0 polyglycolic חומצה בתפר.
- לתת את הבופרנורפין העכבר (0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף subcutaneously (SC)) לפני סיום ההרדמה.
- לא להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד שהוא יהיה בהכרה מלאה. ניהול כאב טיפול עם buprenophine 0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף מנוהל SC שלוש פעמים ביום למשך שלושה ימים אחרי הניתוח כפי שאושר על ידי הגוף המוסדי פיקוח.
- עבור רקמות לקצור, עזים ומתנגד העכברים הנמען כפי שתוארו לעיל, מיושרות כלי בתמיסת באגירה פוספט (PBS) ואחריו 4% פורמלדהיד/PBS, (pH = 7.4) על ידי דקירה בלב. הסר בעדינות את השתלים. לאחר קיבוע לילה 4% פורמלדהיד/PBS, תהליך דגימות בהמשכים, להטביע פרפין.
Representative Results
העכברים התאוששה הרדמה תוך 15-30 דקות עם ליקוי פיזי, נצפתה אין למרות שהיה סיכון גבוה של קרישי דם. אולטראסאונד שימשה במהלך המעקב לאחר הניתוח. העכברים פראי סוג השתמשו במחקר הציג שאין שינוי ממדי שלהם לומן. בהתאם לכך, לא stenoses ולא aneurysmal תצורות נצפו. החיות ההשתלה נכשלה מוצג התפתחות רובד של כלי הדם (איור 2).
קונבנציונלי הליכים מכתימים כגון פראפין יכול לשמש כדי לקבוע את הפלאק, דפוס של תאי שריר חלק, והצטברות של מקרופאגים. במחקר שלנו היסטולוגית ובוצע נוגדן 6 שבועות לאחר הרכבה כדי לבדוק את התקינות של השתל. צביעת היסטולוגית (Hematoxylin אאוזין (HE), immunohistochemical מכתים (אקטין שריר חלק (SMA) ו מקרופאג (MAC2)) (איור 3) הראה לנו ללא שינוי דפוסי ההפצה של תאי שריר חלק, ללא פגע תא אנדותל רירית, ולא הצטברות תאים אינטימה. ממצאים אלה מצביעים על כי אין הפעלת משמעותית של הנגע או תא זוהה כלי המושתל (איור 3).
איור 1 : שרוול טכניקה. . העורק הראשי הושתלה בטכניקה שרוול. בהליך זה, אבי העורקים של התורם הושם בתנוחה orthotopic עם נוכחות כלי האכלה שטחית עקיצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : פוסט תמונות אולטרסאונד. דוגמאות מהנוף פוסט ניתוחית (necropsy) של השתלים 6 שבועות לאחר השתלת (A), שלה אולטרסאונד תלת ממדי (B) ו- B-מצב תצוגה (C). לעקוב לאחר הניתוח נערך באמצעות אולטרסאונד. התמונות להראות patency של השתל ללא שינוי בממדי לומן. בנוסף, לא stenoses או תצורות aneurysmal נצפו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : היסטולוגית ותמונות אימונוהיסטוכימיה. היסטולוגית ו אימונוהיסטוכימיה נציג דמויות של חיות המושתלים בגיל 6 שבועות לאחר ההשתלה. אין חבלות משמעותיות נצפתה על ידי היסטולוגיה aortas המושתלים (Hematoxylin ואאוזין, הוא, 100 X הגדלה, סולם בר = 50 מיקרומטר), immunohistochemical מכתים (שריר חלק אקטין SMA (אדום) או מקרופאג MAC2 (ירוק), 200 X הגדלה, סולם בר = 25 מיקרומטר). הגרעינים היו נגד מוכתמת דאפי (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
לפני מחקר זה היו שונים דגמים אחרים השתלת בעכברים ביסודיות ניתחו3,6,7,10,13,14. המודל של השתלת אב העורקים באמצעות הטכניקה שרוול עם שינויים על-ידי. Dambrin et al. נבחר כפי זה לקריטריונים שלנו והראו אמינות גבוהה של ההשקה השרוול לעומת שיטות קונבנציונליות תפר קצה-לקצה 1 , 10.
טכניקה זו היא חיובית מבחינות רבות עם מלחציים צולבים זמן מופחת במידה ניכרת למזער את הנזק העורקים במהלך הניתוח. שיעור נמוך של פקקת נצפתה בנוסף חוסר התאמה פוטנציאלית קוטר הכלי בין התורם הנמען. התצפיות הנ ל לבצע טכניקה זו המתאים מאוד לצרכי חוקר מחלת כלי דם באבי העורקים השתלות בעכברים.
במחקר מעקב שבו בוצע אולטרסאונד 8 שבועות לאחר ההשתלה, אותרו ללא שינויים משמעותיים. זה אישר הנחות כי נזק העורקים במהלך הניתוח יהיה מינימלי1.
ההליך grafting שהוצגו במאמר זה מבטיח אין ליקוי הן שלמות שתל והן את תפקידה. לכן, ניתן להסיק שמקדם את מודל השתלת ניסיוני זה עשוי לשמש כלי רב ערך עבור חקירות תרופתי המולקולריים עתידיות למחלות ניווניות כלי בעכברים מהונדסים גנטית.
אנו מאמינים כי מדריך וידאו יכולה לתפקד מלמד הממחיש את השימוש של מודל arterio-עורקים פשוטה זה שזה יתרום יותר פורה לדיון בנושאים חשובים רבים בפתולוגיות כלי הדם. ניתן להשתמש בשיטה זו השקה מהירה מאוד ללמוד מחלת כלי דם בעכברים מהונדסים גנטית. זה עשוי לשמש גם שינוי במודל מפרצת בשילוב עם השתלת.
ישנן נקודות קריטיות במהלך ההליך. הצבת התפר עצמו הוא השלב הקריטי ביותר. המנתח חייב לטפל כדי למנוע כל פיתול של אבי העורקים על ידי יישור תקין של התורם, הנמען. התפסים יוסרו בקפידה לאחר בדיקה של ההשקה. מוטב שנשחרר את המלחציים דיסטלי תמיד קודם וכתוצאה מכך לחץ נמוך מחזיק הקירות יחד לפני שחרורו proximal בצד בלחץ גבוה. היה מדמם. תוצאה לא תקינה בעקבות הרצף של שחרור.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות רומא Wieczorek, פיטר Kurdybacha לסיוע עריכה מעולה שלהם, ואת ליאון דקר Uli Heuter לסיוע טכני מעולה שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A.
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C.
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).
