Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लंबे zebrafish सीएनएस में ट्रांसजीन, विकास 1 पर विशेष रूप से उनके प्रभाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी सेलुलर मस्तिष्क के विकास, मांसपेशियों पीढ़ी है, और कई अन्य विकासात्मक घटनाओं 2 में शामिल प्रक्रियाओं की एक विस्तृत मानचित्रण अनुमति दी गई है। एक व्यक्ति के सेल की मौत का अध्ययन अधिक चुनौतीपूर्ण हो गया है, मुख्य रूप से मानक इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान चयनात्मक कोशिका मृत्यु उत्प्रेरण के तकनीकी कठिनाइयों के कारण। हालांकि, एकल कोशिका संकल्प इमेजिंग और अत्यधिक लक्षित पृथक तकनीक के संयोजन तनाव और चोट करने के लिए तत्काल सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच, साथ ही फलस्वरूप सेल सेल बातचीत के रूप में अनुमति देता है। इन प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से इस तरह के मोटर न्यूरॉन बीमारी (MND), जहां न्यूरॉन glia बातचीत प्रगति में योगदान करने के लिए दिखाया गया है के रूप में neurodegenerative रोगों के लिएरोग 3 की।
MND, या Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस), एक विनाशकारी neurodegenerative रोग brainstem, मोटर प्रांतस्था, और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित करता है। इन न्यूरॉन्स की हानि मांसपेशियों की हानि की ओर जाता है, और रोगियों को 3 के भीतर मर जाते हैं – निदान 4 से 5 साल। मांसपेशी फाइबर करने के लिए रीढ़ की हड्डी की कड़ी में मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के संकुचन को सुविधाजनक बनाने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस संचार या इन न्यूरॉन्स की मौत की विफलता धीरे-धीरे मांसपेशियों को कमजोर और मरीज की, निगल करने के लिए चलते हैं, बोलते हैं, और साँस लेने की क्षमता को प्रभावित करता है। एक जीवित जानवरों में एक मोटर न्यूरॉन और छोटी अवधि के परिणामों की मौत Visualizing बेहतर सामान्य सेल homeostasis और रोग में शामिल गतिशील प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है।
Zebrafish neurodegenerative रोगों 1 अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। इसऐसे बाह्य निषेचन, लघु विकास समय, तंत्रिका तंत्र के लिए ऑप्टिकल का उपयोग, और transgenesis की आसानी के रूप में, इस मॉडल जीव द्वारा की पेशकश की लाभ की वजह से है। इसके अलावा, क्षमता आसानी से यौगिक ट्रांसजेनिक zebrafish उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के कई रणनीतियों लेबलिंग के लिए अनुमति देता है। जेनेटिक पृथक विशेष प्रकार की कोशिकाओं बल्कि व्यापक अशांति की अनुमति है, लेकिन अलग-अलग कोशिकाओं 5 को निशाना बनाने का ठीक नियंत्रण की कमी को मारने के लिए दृष्टिकोण। लेजर तकनीक की मदद से, दूसरे हाथ पर, ठीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण प्रदान करते हैं और विभिन्न पशु मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है। जबकि इस तरह के रूप में सबसे अधिक तरीकों का इस्तेमाल विशेष उपकरणों, स्पंदित लेसरों 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 या दो photon सेट-अप 13, अन्यअनुसंधान समूहों ने हाल ही में पारंपरिक confocal सूक्ष्मदर्शी 14 में एक यूवी लेजर का लाभ ले लिया है।
तकनीक यहाँ वर्णित एक यूवी लेजर की मध्यस्थता दृष्टिकोण चयनित मोटर न्यूरॉन्स में एक खुराक पर निर्भर रास्ते में सेलुलर तनाव या मौत का कारण के साथ उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी जोड़ती है। यह 405 एनएम लेजर आमतौर पर स्थापित के उपयोग पर निर्भर करता है, सेल संस्कृति में और रहने वाले जानवरों में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, और इस तरह के neuronal मौत के बाद microglial निकासी के रूप में सेलुलर बातचीत के विस्तृत लक्षण वर्णन अनुमति देता है।
लेजर पृथक दृष्टिकोण
लेजर की मदद से पृथक तकनीक कोशिकाओं के व्यक्तिगत या छोटे समूहों की सटीक लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति है। उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी और ऐसे zebrafish के रूप में पशु मॉडल में आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ इस तकनीक का मेल शोधकर्ताओं ने योजनाबद्ध तरीके से एक व्यक्ति के सेल के भाग्य और चोट के बाद बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।
यूवी (405 एनएम) लेजर पृथक यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रूपरेखा कैसे व्यक्ति की कोशिकाओं पर जोर दिया जा सकता है या मारे गए चुनिंदा (एक खुराक पर निर्भर ढंग से), न्यूरॉन्स, glia पड़ोसी जबकि, और एक्सोन अहानिकर छोड़ दिया जाता है। हम सफलतापूर्वक सेल संस्कृति प्रयोगों में इस दृष्टिकोण का उपयोग किया और यहां zebrafish रीढ़ की हड्डी के लिए विस्तृत दृष्टिकोण का वर्णन किया है। हम चुनिंदा अन्य कोशिकाओं (चित्रा 5, ए और के एक नेटवर्क के भीतर एक व्यक्ति न्यूरॉन पर बल देते द्वारा zebrafish रीढ़ की हड्डी में इस दृष्टिकोण के कार्यान्वयन दिखाने <strong> बी), या तुरंत और वसूली के बिना एक न्यूरॉन की हत्या करके (चित्रा 5, सी और डी)।
इससे पहले, ऐसी स्पंदित नाइट्रोजन लेजर या दो photon लेजर प्रणाली के रूप में विशेष लेजर प्रणाली, ऊतकों को नुकसान और मोटर तंत्रिका लेनदेनों 10, 11, 12, 13 के लिए प्रेरित करने के लिए आवश्यक थे। ये लेजर प्रणाली सफलतापूर्वक ऐसी धमनियों और नसों में 6 घनास्त्रता, तीव्र गुर्दे की चोट 7, हृदय चोट 8 के रूप में सेल की क्षति, पैदा करने के लिए है, और कैल्शियम लहरों और मस्तिष्क की चोट के बाद 9 microglial प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इसके अलावा, Soustelle और उनके सहयोगियों ड्रोसोफिला 14 <उपकला करने और glial कोशिकाओं को नुकसान प्रेरित करने के लिए एक पारंपरिक confocal सेटअप (351 एनएम और 364 एनएम यूवी लेजर) का इस्तेमाल किया/ Sup>।
ए एल एस समझना के लिए Zebrafish मॉडल की प्रासंगिकता (और अन्य मानव रोग)
Zebrafish विशेष रूप से विकास अध्ययन 28, 29, 30 के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीव हैं। वे कुछ सीमाएं हैं, वहीं मानव रोग मॉडल और रोगजनक आणविक तंत्र की समझ देने के लिए उनके संभावित भारी है। Zebrafish मॉडल MND के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और महत्वपूर्ण आणविक अंतर्दृष्टि 31, 32, 33, 34 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों तेजी से उत्पन्न किया जा सकता है (4 – 5 माह) और एक विशेष सेल प्रकार, सुविधाओं है कि उन्हें ए एल एस के मौजूदा पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त कर के चुनिंदा ट्रैकिंग अनुमति देते हैं। Zebrafish भ्रूण / लार्वा ऑप्टिकली पारदर्शी हैं और अनूठा अनुभव प्रदान करते हैंमानसिक लाभ है कि मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी है, जो आसानी से (या मानव में) कृंतक मॉडल में हासिल नहीं किया जा सकता है में एकल कोशिका के स्तर पर लंबे समय तक रहते इमेजिंग अनुमति देते हैं। जब इस तरह के एकल कोशिका पृथक रूप में आणविक तकनीक के साथ संयुक्त, इस विवो में सटीक आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है प्रयोगात्मक।
मोटर न्यूरॉन्स चुनिंदा यूवी लेजर पृथक का उपयोग लक्षित किया जा सकता
Zebrafish में रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के जन्म के बाद 10 घंटे के भीतर विकसित करने के लिए शुरू करते हैं और लगभग 48 घंटे के बाद 35, 36 की स्थापना कर रहे हैं। यह तेजी से विकास कम समय फ्रेम में और उच्च throughput के साथ इन न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए अनुमति देता है। मोटर न्यूरॉन्स मस्तिष्क और मांसपेशियों के बीच आवश्यक कड़ी प्रदान करते हैं और, ए एल एस में, मोटर प्रांतस्था (ऊपरी मोटर न्यूरॉन्स), मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी (कम मोटर न्यूरॉन्स) में प्रभावित कर रहे हैं। इन न्यूरॉन्स की हानि अनिवार्य रूप से म्यू की ओर जाता हैscle शोष और कमजोरी। Zebrafish की रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स उनके अलग अनुमानों से और -3MNX1 की तरह मोटर न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटरों के उपयोग से पहचाना जा सकता है। इस तरह पेश न्यूरॉन्स की सेल सोम लक्ष्य निर्धारण समय (चित्रा 4 और वीडियो 1) पर axonal प्रक्षेपण के साथ अग्रगामी अध: पतन का पता चला। रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स की एकल कोशिका संकल्प इमेजिंग अतिरिक्त लेजर पृथक (चित्रा 4 और संदर्भ 27 में पूरक वीडियो 3 देखें) के बाद phosphatidylserine स्थानान्तरण और फलस्वरूप Annexin वी लेबलिंग की पुष्टि की। हालांकि हम अपनी यूवी लेजर पृथक दृष्टिकोण के बाद न्यूरॉन्स मरने में Annexin वी के सक्रियण की रिपोर्ट है, हम निश्चित है कि मौत का झरना है कि इस त्वरित प्रक्रिया के दौरान शुरू हो रहा है वास्तव में neuronal मौत कि neurodegeneration या सामान्य सेल homeostasis के दौरान होता है मैच नहीं हो सकता है।
हालांकि इस पृथक दृष्टिकोण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैऔर विशिष्ट, विभिन्न रणनीतियों एम्बेडिंग भी यूवी पृथक की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। हमारे अनुभव में, यह सबसे agarose हम में हमारे मछली एम्बेडेड की परत को कम करने में सफल रहा था। अंडे पानी के एक अतिरिक्त परत के साथ मध्यम embedding क्षीणन और बिखरने प्रभाव है कि होने के कारण अंतत: सेल द्वारा प्राप्त यूवी शक्ति को कम कर सकते हैं की परतों मोटा किरण मार्ग के किनारे।
भविष्य में, अलग-अलग ट्रांसजेनिक मछली लाइनों के पार (12 घंटे तक) इस तरह के glia के रूप में अन्य प्रभावित कोशिकाओं, की प्रतिक्रियाएं, लेजर प्रेरित सेल विनाश करने के लिए तत्काल और अल्पकालिक के दृश्य के लिए अनुमति देगा। उदाहरण के लिए, astrocyte और इस तरह के ए एल एस के रूप में neurodegenerative विकारों में गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता अनुसंधान सुर्खियों में रहे हैं और भारी छिटपुट और पारिवारिक ए एल एस 37, 38 की pathogenicity में फंसा रहे हैं। हालांकि, तंत्र glial विषाक्तता और चयनात्मकता अंतर्निहितमोटर की ओर न्यूरॉन्स अस्पष्ट रहते हैं। हम और दूसरों को हाल ही में microglia द्वारा न्यूरॉन्स मरने का घिराव अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का फायदा उठाया और न्यूरोनल अवशेष 27, 39, 40 की निकासी कल्पना।
उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी और neuroinflammation के लिए मार्कर के साथ पृथक तकनीक का मेल भविष्य में शोधकर्ताओं ने एकल कोशिका समारोह और परस्पर सेल प्रणाली की समझ का विस्तार करने की अनुमति देगा। एक विवो सेटिंग में इन प्रक्रियाओं की विशेषता विकासात्मक सेटिंग्स में बल्कि MND, जहां सेलुलर बातचीत 3 प्रभावित हो सकता है, 41 सहित neurodegenerative रोगों के मॉडल में न केवल महत्वपूर्ण है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
Microscope | Leica | SP5 | |
35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |