Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Fluorescensmikroskopi har länge använts för att studera effekterna av transgener i zebrafisk CNS, särskilt deras effekter på utvecklingen 1. Högupplöst mikroskopi har gjort en detaljerad kartläggning av de cellulära processer i hjärnans utveckling, muskel generation, och många andra utvecklings evenemang 2. Studera död en enskild cell har varit mer utmanande, främst på grund av de tekniska svårigheterna att inducera selektiv celldöd under normal avbildningsförfaranden. Kombinationen av encelliga upplösning avbildning och välriktade ablation tekniker gör det möjligt att utreda omedelbara cellulära svar på stress och skador, liksom de därav följande cell-cell interaktioner. Att förstå dessa processer är kritisk, särskilt för neurodegenerativa sjukdomar såsom motorneuronsjukdom (MND), där neuron-Glia interaktioner har visat sig bidra till utvecklingenav sjukdomen 3.
MND, eller amyotrofisk lateralskleros (ALS), är en förödande neurodegenerativ sjukdom som påverkar motoriska neuroner i hjärnstammen, motoriska cortex och ryggmärgen. Förlust av dessa neuroner leder till muskel förlust, och patienter dör inom 3 – 5 år efter diagnos 4. Motoriska nervceller i ryggmärgen länk till muskelfibrer och spelar en viktig roll när det gäller att underlätta muskelsammandragning. Fel i detta meddelande eller död av dessa nervceller gradvis försvagar musklerna och påverkar patientens förmåga att svälja, gå, tala och andas. Visualisera döden av en motorneuron och de kortsiktiga konsekvenser i ett levande djur ger ett utmärkt tillfälle att bättre förstå de dynamiska processer som ingår i normal cell homeostas och sjukdom.
Zebrafisk har dykt upp som en attraktiv modell för att studera neurodegenerativa sjukdomar 1. Dettaberor på de fördelar som denna modellorganism, såsom yttre befruktning, kort utvecklings tid, optisk access till nervsystemet och enkel genmodifiering. Dessutom, förmågan att enkelt generera föreningen transgen zebrafisk möjliggör multipla märkningsstrategier olika celltyper. Genetisk ablation metoder för att döda specifika celltyper tillåter ganska bred störning, men saknar den fina kontroll av inrikta sig på enskilda celler 5. Laserassisterade tekniker, å andra sidan, ge fina temporal och spatial kontroll och har använts för olika djurmodeller. Medan de flesta metoder använder specialutrustning, såsom pulsad laser 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller två-photon uppställningar 13, andraforskargrupper har nyligen dragit nytta av en UV-laser i konventionella konfokala mikroskop 14.
Den teknik som beskrivs här kombinerar hög upplösning konfokalmikroskopi med en UV-laser-medierad metod för att orsaka cellulär stress eller död i ett dosberoende sätt i valda motomeuroner. Det bygger på användning av den allmänt installerat 405-nm laser, har testats med framgång i cellodling och i levande djur, och gör det möjligt att detalj karakterisering av cellulära interaktioner, såsom microglial clearance efter nervcellsdöd.
Laserablation Approaches
Laser-assisted ablation tekniker möjliggör exakt inriktning av enskilda eller små grupper av celler. Kombinera denna teknik med hög upplösning mikroskopi och genetiska manipulationer i djurmodeller såsom zebrafisk tillåter forskare att systematiskt undersöka ödet för en enskild cell och samspelet efter skada.
UV (405 nm) laserablation Protokollet som beskrivs här beskrivs hur enskilda celler kan understrykas eller dödas selektivt (i en dosberoende sätt), medan grann neuroner, glia och axoner lämnas oskadda. Vi har framgångsrikt utnyttjat denna metod i cellodlingsexperiment och beskriver här detaljerad strategi för zebrafisk ryggmärgen. Vi visar genomförandet av denna strategi i zebrafisk ryggmärgen genom att selektivt betona en enskild neuron i ett nätverk av andra celler (Figur 5, A och <strong> B), eller genom att döda en enda neuron omedelbart och utan återvinning (Figur 5, C och D).
Tidigare, specialiserade lasersystem, såsom pulsad-kvävelaser eller två-fotonlasersystem, erfordrades för att inducera vävnadsskada och motorisk nerv transections 10, 11, 12, 13. Dessa lasersystem har framgångsrikt används för att orsaka cellskada, såsom trombos i artärer och vener 6, akut njursvikt 7, hjärtskada 8 och studera kalciumvågor och microglial svar efter hjärnskada 9. Dessutom Soustelle och kollegor använde en konventionell konfokala setup (351 nm och 364 nm UV-lasrar) för att inducera skador på epitel- och gliaceller i Drosophila 14 </ Sup>.
Betydelsen av Zebrafish modeller för att förstå ALS (och andra sjukdomar hos människor)
Zebrafisk är ett vanligt modellorganism, särskilt för utvecklingsstudier 28, 29, 30. Medan de har vissa begränsningar, är deras potential att modellera sjukdomar hos människan och ge en förståelse för patogena molekylära mekanismer enorm. Zebrafisk modeller har väletablerad för studier av MND och har lett till viktiga molekylära insikter 31, 32, 33, 34. Transgena zebrafisk linjer kan snabbt genereras (4 – 5 månader) och låt den selektiva spårning av en viss celltyp, egenskaper som gör dem ett värdefullt tillskott till nuvarande djurmodeller av ALS. Zebrafisk embryon / larver är optiskt transparenta och erbjuder unika erfamentala fördelar som tillåter långtids levande-imaging vid encelliga nivå i hjärnan eller ryggmärgen, som inte lätt kan uppnås i gnagarmodeller (eller hos människa). När de kombineras med molekylära tekniker, såsom encelliga ablation, ger detta en unik experimentplattform för att studera exakta molekylära mekanismer in vivo.
Motomeuroner kan selektivt riktad Använda UV Laser Ablation
Spinal nervceller i zebrafisk börjar utvecklas inom 10 timmar efter födseln och är etablerade efter ca 48 h 35, 36. Den snabba utvecklingen gör visualisering av dessa neuroner i korta tidsramar och med hög genomströmning. Motoriska nervceller ge den viktigaste länken mellan hjärnan och musklerna och i ALS, påverkas i motor cortex (övre motoriska nervceller), hjärnstammen och ryggmärgen (lägre motoriska nervceller). Förlust av dessa neuroner leder oundvikligen till muscle atrofi och svaghet. Motoriska nervceller i ryggmärgen hos zebrafisk kan identifieras genom sina olika prognoser och genom användning av motorneuronspecifika promotorer som -3MNX1. Inriktning cell soma sådana utskjutande nervceller avslöjade antero degeneration längs axonal projektion över tiden (Figur 4 och Video 1). Encelliga upplösning avbildning av spinal motoriska nervceller dessutom bekräftat fosfatidylserin translokation och åtföljande Annexin V-märkning efter laserablation (se figur 4 och kompletterande Video 3 i Reference 27). Även om vi rapporterar aktiveringen av Annexin V i döende nervceller efter vår UV-laser ablation tillvägagångssätt, kan vi inte vara säkra på att den kaskad av död som utlöses under denna påskyndade processen exakt matchar nervcellsdöd som inträffar under neurodegeneration eller normal cell homeostas.
Medan denna ablation tillvägagångssätt är mycket reproducerbaroch specifika, olika inbäddningsrestriktioner strategier kan också påverka effektiviteten av UV ablation. I vår erfarenhet var det mest framgångsrika för att minimera lager av agaros vi inbäddade vår fisk i. Tjockare skikt av inbäddningsmedium med ett extra lager av ägg vatten kan minska UV kraften slutligen mottas av cellen på grund av dämpning och spridnings effekter som uppstår längs med strålbanan.
I framtiden kommer korsning av olika transgena fisk linjer möjliggör visualisering av den omedelbara och kortsiktiga (upp till 12 h) svaren från andra drabbade celler, såsom glia, till laserinducerad cellförstöring. Till exempel har astrocyternas och icke-cell autonom toxicitet i neurodegenerativa sjukdomar såsom ALS varit i forskningsrampljuset och är starkt inblandad i sjukdomsframkallande egenskaper hos sporadisk och familjär ALS 37, 38. Men mekanismerna bakom gliaceller toxicitet och selektivitetmot motoriska nervceller fortfarande oklara. Vi och andra nyligen tog fördel av denna metod för att studera omvälvning av döende nervceller av mikroglia och visualiseras clearance av neuronala rester 27, 39, 40.
Kombinera ablation teknik med hög upplösning mikroskopi och markörer för neuroinflammation kommer att tillåta forskare i framtiden att öka förståelsen av encelliga funktion och sammankopplade cellsystem. Karakterisering av dessa processer i ett in vivo inställning är kritisk inte bara i utvecklings inställningar utan även i modeller av neurodegenerativa sjukdomar, däribland MND, där cellulära interaktioner kan försämras 3, 41.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Pronase | Sigma | 10165921001 | |
Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
Microscope | Leica | SP5 | |
35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |