戒毒治疗和<em>在体内</em>在青鳉鱼骨质疏松模型成骨破骨细胞相互作用的成像
Summary
Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.
Abstract
骨形成的成骨细胞与骨再吸收的破骨细胞相互作用，以协调的骨基质的营业额，并控制骨骼稳态。青鳉和斑马鱼幼体被广泛用于分析骨细胞的骨形成，变性，修复期间的行为。其光学清晰度允许荧光标记的骨细胞和结合到矿化的骨基质的荧光染料的可视化。我们的实验室已产生的转基因黑点青鳉鱼表达热激诱导型启动子的控制下的破骨细胞诱导因子核因子κB配体（RANKL）的受体激活剂。在过量形成活化的破骨细胞，其可以在记者线路用nlGFP表达的组织蛋白酶K（CTSK）启动子的控制下，被可视化的RANKL结果的异位表达。 RANKL诱导和异位破骨细胞形成导致了严重的骨质疏松样的表型。复合转基因青鳉李表达CTSK内斯：nlGFP在破骨细胞，以及在过早的成骨细胞的osterix的 （OSX）启动子的控制下，mCherry，可用于研究两种细胞类型的相互作用。这有利于细胞行为骨退化和修复的条件下， 在体内观察。在这里，我们描述了使用该系统的测试在人骨质疏松症的治疗中通常使用的药物和描述了用于实时成像的协议。在青鳉模型补充在细胞培养物和小鼠中的研究，并提供一种新颖的系统，用于骨骼系统药物作用的体内分析。
Introduction
脊椎动物骨架提供了器官的结构支撑和保护，允许的移动性，并作为钙源。在整个生命中，细胞外骨基质连续上交保持骨的稳定性和刚性。这个过程需要紧密协调的活性和骨形成的成骨细胞和骨再吸收的破骨细胞的相互作用。成骨细胞是从多能间充质祖细胞衍生的和产生胶原，以形成类骨质，骨基质10的蛋白质的部分。成骨细胞的破骨细胞相互作用以实现这两种细胞类型，这是需要控制骨稳态7的平衡的活性。由于这些复杂的调控相互作用，药物治疗和骨稳态反应不能充分使用体外研究审查。因此，存在对动物模型的强烈需求。相比于细胞培养物的设置， 在体内模型可以提供有价值的洞察骨环境中的多细胞网络。
众多的小鼠模型，适用于各种人类骨骼疾病包括骨质疏松症16存在。但是，大小和小鼠胚胎的无障碍代表骨架过程实时成像显著局限性。小硬骨鱼，另一方面，作为体内成像一个有吸引力的替代方案。斑马鱼（ 斑马鱼 ）和青鳉（ 青鳉 ）已经成为骨骼研究流行的动物模型，在过去二十年中17，19，22，24。骨在硬骨鱼和哺乳动物是非常相似的，无论在结构和生理水平，和许多关键调节基因和信号途径的是保守3。作为哺乳动物，硬骨鱼仔细调节成骨细胞和破骨细胞，以平衡骨形成和骨吸收26的活性。最重要的是，网络连接的光学透明性sh的幼虫允许使用荧光报告标记骨细胞和钙化骨骼基质8，9，12，21，23，这有利于细胞过程在活的动物中观察。另外，已经产生了一系列的遗传工具，以促进在鱼类生物医学相关的研究。特别是对于青鳉，用于通过CRISPR / Cas9 2，细胞谱系追踪6，和转基因14最近已建立和现在都在使用15广泛点特异性靶向基因突变的方法。
小硬骨鱼类幼虫已成功地用于化工屏幕，这导致了一些药理相关药物1,18发现。
鱼幼体耐受低浓度的DMSO，并且能够吸收化合物从它们的水生环境中，无论是通过皮肤或通过胃肠道1,5。我们以前的实验室代表表达在骨细胞荧光报告各种osteoblast-和破骨细胞特异性启动子的控制下orted转基因黑点青鳉的行。这些包括过早成骨细胞（ 骨胶原10A1，COL10A1; osterix的 ，OSX）20，21，成熟的成骨细胞（ 骨钙蛋白 ，OSC）27，和破骨细胞（ 组织蛋白酶K，CTSK）24。我们还产生了一个热休克诱导型启动子24的控制下表达的破骨细胞诱导因子核因子κB配体（RANKL）的受体激活剂的转基因线。
在这个系统中RANKL诱导导致异位形成活跃的破骨细胞。这导致增加的骨吸收和严重的骨质疏松症样表型，与在椎体急剧降低矿化。我们最近发现，在此模型中的破骨细胞活性可通过二膦酸盐依替和阿仑，总重量被阻止Ø药物在人类治疗骨质疏松症常用，从而验证青鳉作为一个合适的模型系统，骨质疏松症27。
由于其大尺寸育雏，快速发展，胚胎的体积小，转基因青鳉幼虫是唯一适用于骨质疏松症药物的大规模筛选和骨细胞行为的体内分析。在青鳉研究从而可以有效地在细胞培养物和在那些旨在发现新的治疗靶点和新疗法为人类骨疾病的小鼠互补实验。
在本研究中，我们描述了一个协议，把青鳉骨记者幼虫常见的骨质疏松症药物阿仑膦酸钠。我们还详细描述了如何治疗幼虫安装和骨基质和骨细胞的实时成像准备。这些协议可以很容易地适用于其他的小的化学化合物，要么工作作为骨合成或抗骨吸收的药物。</ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
该议定书中的关键步骤
至关重要的是，比较不同样品时对热休克处理的条件是一致的和稳定的。稳定的温度条件下保证RANKL诱导的相似的水平在转基因幼虫，因此，可比破骨细胞形成，其可以通过筛选CTSK予以确认：nlGFP表达。最终，这将导致类似的程度诱导异位骨吸收和骨质疏松症样病变，如通过ALC染色验证。这样的实验设计，然后允许确定和各种抗吸收药物或以不同的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这个项目是由教育的新加坡教育部（MOE，授权号2013-T2-2-126）和健康，美国国家研究院（NIH，授予数量1R21AT008452-01A1）赠款。 TY从生物科学系新加坡国立大学获得了硕士研究生奖学金。我们感谢新加坡国立大学中心生物成像科学（CBIS）的共焦单位的一贯支持。
Materials
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μl |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
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