Kvantitativt kartlegge metaller i vev av laser ablasjon – induktivt koblet plasma – massespektrometri (LA-ICP-MS) er en følsom analytisk teknikk som kan gi ny innsikt i hvordan metaller delta i normale funksjon og sykdomsprosesser. Her beskriver vi en protokoll for kvantitativ avbildning metaller i tynne snitt av mus nevrologisk vev.
Metaller finnes overalt gjennom en organisme, med deres biologiske rolle diktert av både deres kjemiske reaktivitet og overflod innenfor et spesifikt anatomisk område. I hjernen, metaller har en meget romoppdelt fordeling, avhengig av den primære funksjon de spiller innenfor det sentrale nervesystemet. Imaging den romlige fordelingen av metaller har gitt unik innsikt i den biokjemiske arkitekturen i hjernen, slik at direkte sammenheng mellom nevroanatomi regioner og deres kjente funksjon med hensyn til metallavhengige prosesser. I tillegg inneholder flere aldersrelaterte nevrologiske lidelser forstyrret metall homeostase, som ofte er begrenset til små områder av hjernen som ellers er vanskelig å analysere. Her beskriver vi en omfattende metode for kvantitativ avbildning metaller i mus hjernen, ved hjelp av laser ablasjon – induktivt koblet plasma – massespektrometri (LA-ICP-MS) og spesialdesignet bildebehandlingprogramvare. Med fokus på jern, kobber og sink, som er tre av de mest tallrike og sykdomsrelevante metaller i hjernen, beskriver vi de grunnleggende trinnene i prøveopparbeidelse, analyse, kvantitative målinger og bildebehandling for å produsere kart metall distribusjon i lav mikrometer oppløsning rekkevidde. Denne teknikk, som gjelder for en hvilken som helst snitt vev avsnitt, er i stand til å demonstrere den meget variabel fordeling av metaller innenfor et organ eller system, og kan brukes til å identifisere endringer i metall homeostase og absolutte nivåer innenfor fin anatomiske strukturer.
Den unike redoks-kjemien av metaller muliggjør en rekke neurologiske funksjoner, herunder signalomforming, energiproduksjon og neurotransmitter syntese. I et antall større neurodegenerative sykdommer, har dyshomeostasis av disse metaller vært både implisert i patogenesen sykdom og identifisert som potensielle nye mål for terapeutisk intervensjon 1. For bedre å forstå hvordan metaller er involvert i tilstander slik som Alzheimers og Parkinsons sykdom (AD og PD, henholdsvis), er det viktig å være i stand til å måle hvor metallfordeling og nivå endres innenfor områdene negativt påvirket av sykdomsprosessen. Disse endringene er ofte en indikasjon på subtile endringer i biokjemiske reaksjoner som kan være nært knyttet til de prosessene som setter i gang celledød, slik som vår nylig foreslåtte mekanismen av jern og dopamin nevro i PD 2.
Tradisjonelt metal nivåer innenfor definerte anatomiske regioner er oppnådd gjennom forsiktig excision, fordøyelse og analyse ved hjelp av en rekke analytiske teknikker 3. Men en slik tilnærming mister romlig informasjon, noe som kan være avgjørende når sykdomstilstander under etterforskning involverer små, veldefinerte regioner eller spesifikke celletyper. En rekke analysefremgangsmåter er tilgjengelige for å visualisere metaller i biologiske systemer, fra intakte prøvene til vevssnitt og i to og tre dimensjoner, ved hjelp av emisjonsspektroskopi, fluorescerende prober og massespektrometri 4. Hver teknikk har fordeler og ulemper med hensyn følsomhet, selektivitet av kjemiske arter, og romlig oppløsning som kan oppnås. For en omfattende oversikt over omfanget av teknikker tilgjengelig, se anmeldelsen av Hare et al. 5.
Massespektrometri (MS) -baserte metoder er de mest følsomme av disse teknikkene, Som kan måle biologisk mest relevante metaller på sitt eget konsentrasjon seks. Laserablasjon – induktivt koblet plasma – massespektrometri (LA-ICP-MS) avbildning benytter en fokusert ultrafiolett laserstråle som varierer i størrelse fra 1 til> 100 pm i diameter (eller bredde, når en firkantet bjelke formen er brukt), under hvilke prøven passert 7. Kvantitativ informasjon kan oppnås gjennom representanten ablasjon av standard referansemateriale, som kan produseres ved hjelp av en rekke ulike tilnærminger 8, hver med varierende grad av tekniske problemer og analytisk funksjonalitet. Den vanligste tilnærmingen benytter matrise-matching, hvor en standard med en dominerende kjemiske sammensetning sammenlignbar med den for prøven fremstilles ved å tilsette med målanalytten og nøyaktig vurdert for homogenitet og absolutt metallkonsentrasjon av uavhengige analyseorganer 9, </sup> 10. Ablasjon av preparerte standarder kan deretter brukes for eksterne kalibreringsformål, slik at konsentrasjonsdata fra det resulterende prøvebildet som skal ekstraheres per piksel.
Bildeoppløsningen blir bestemt ved både strålen størrelse og hastighet ved hvilken prøven blir skannet. Standarden kvadrupol-designen ICP-MS (som står for over 90% av alle installerte ICP-MS-systemer på verdensbasis 11) er en sekvensiell masse analysator, ved at massen detektor blar gjennom alle valgte masse-til-charge ratio (m / z ) i stedet for å samle inn data samtidig. Således må innsamlingstiden for hver syklus av masser tilsvare den tiden det tar for prøven å traversere en bredde av laserstrålen for å sikre en piksel er representativt for den ønskede oppløsningen er ervervet 12. Laserstråle størrelse valg er en viktig parameter som har betydelige effekter på både sensitivitet og total analyse tid. Som laser ablasjon physitisk fjerner materiale som sveipes av ICP-MS med en argon bæregass, er mengden av materiale som kan være fysisk detektert av analysatoren massen følger den inverse kvadratisk. For eksempel reduserer laserstrålen diameter fra 50 – 25 um resulterer i en reduksjon av ablateres materiale med en faktor på fire. I tillegg, som en skannemetode, mindre diametre bjelke øke den totale tid som kreves for å ablate et valgt område. Derfor er eksperimentell design avgjørende for å balansere den nødvendige romlig oppløsning med sensitivitets behov og tidspress.
Imaging av LA-ICP-MS har vært brukt på en rekke prøver, matriser og sykdomstilstander, inkludert dyremodeller av nevrologiske lidelser 13, 14, traumatisk hjerneskade 15, distribusjon av metallholdig kreft narkotika 16, gifteksponering i morkaken 17 og metall distribution i tennene som en biomarkør for tidlig lige kosttilskudd overganger. 18 I denne protokollen vi beskriver en generell metode for avbilding jern, kobber og sink i den WT musehjerne med en oppløsning på 30 mikrometer, selv om det lett kan tilpasses til en rekke prøvetyper og eksperimentelle resultater, basert på behovene til analytiker.
Imaging metaller i nevrologisk vev er bare ett eksempel på hvordan denne protokollen kan gi nyttig informasjon om utbredelse og mengder av metaller i enhver biologisk matrise. Selv om fremstillingen av standard referansemateriale kan være anstrengende, er det et eksperiment som kan utføres en gang, og arkiveres for senere bruk.
LA-ICP-MS har visse fordeler fremfor alternative metoder, som synkrotron-baserte X-ray fluorescens mikroskopi, for det meste i form av tilgjengelighet og sensitivitet. Men det er visse ulemper som bør vurderes ved utarbeidelse av et eksperiment ved hjelp av LA-ICP-MS, og som sådan er det ofte en nyttig komplementær teknikk for kjemisk bildebehandling som inkluderer alternative metall analyseteknikker, samt komparativ histokjemi 5.
Justering med kjente anatomiske trekk av mus hjernen kan gi nyttig informasjon om mulig funksjonell forholdonship mellom metallnivåer og romlig fordeling. Tidligere har vi brukt Allen Brain Atlas elektronisk ressurs, 29 som er en åpen-tilgang oppbevaringssted for både anatomiske og genuttrykk data i C57BL / 6 mus hjernen til å undersøke romlige korrelasjon av både metall-avhengig enzym uttrykk 14 og nevroanatomi 27, 30. Andre ressurser, for eksempel gnagere Brain WorkBench 31 er også tilgjengelig for å bistå med registrering og justering av metallbilder for å bistå i riktig identifikasjon av metall distribusjon i ofte små anatomiske regioner.
Anvendelser av denne teknikken er nyttig for å vurdere hvordan metallnivåer og distribusjon endring på mikro gjennom både normale livshendelser (for eksempel aldring) og i sykdomstilstander; så vel som å studere effekten av både metallholdige forbindelser og medikamenter utformet for å målrette megtal metabolisme. Dagens store begrensninger i LA-ICP-MS som en avbildningsteknikk for romlig vurdere metall distribusjon er gjennomstrømming og følsomhet. Det er et kompromiss mellom hastighet på analyse og romlig oppløsning 5, 12, med høyere oppløsning som krever lengre analysetider. Teknikken er godt egnet for biologiske elementer ved høyere konsentrasjoner, selv om elementer som mangan, kobolt og selen er begrenset på grunn av deres lave mengder i normalt vev og / eller begrensninger i deres deteksjon ved konvensjonell ICP-MS. Nye fremskritt i ICP-MS teknologi, for eksempel innføring av trippel-kvadrupol masse analysatorer, gir mulighet for målrettet påvisning av vanskelige analytter, så som selen 32 ved høy følsomhet 33. Som et teknologidrevet prosedyre, fremskritt innen både laser og massespektrometri design vil se denne avbildningsteknikk fortsette å utvikle seg, økerhastigheten på analyse og følsomhet 34.
The authors have nothing to disclose.
DJH og PAD er støttet av en australsk Forskningsrådet Heis Project (LP120200081) med Agilent Technologies og ESI Ltd. Bidraget fra BK ble støttet av Ruhr-universitetet forskerskolen PLUS, finansiert av Tysklands Excellence Initiative [DFG GSC 98/3]. DJH ble delvis støttet av Ramaciotti Foundation. KK er støttet av Sigrid Juselius Foundation.
Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
Parafomaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P5368 | Pre-mixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
Iso-pentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
Excel | Microsoft | n/a | |
IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |