इस पत्र इमेजिंग फ्लो का उपयोग कर टी कोशिकाओं की एक मिश्रित आबादी में alloreactivity मापने के लिए एक विधि का वर्णन है।
प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में दाता एंटीजन को प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया की माप सफल कमी या प्रतिरक्षादमन की वापसी के लिए महत्वपूर्ण होने की संभावना है। मिश्रित ल्युकोसैट प्रतिक्रिया (एमएलआर), सीमित कमजोर पड़ने assays, और ट्रांस-विवो विलंबित प्रकार अतिसंवेदनशीलता (डीटीएच) परख सब इस सवाल का लागू किया गया है, लेकिन इन तरीकों भविष्य कहनेवाला क्षमता और / या महत्वपूर्ण व्यावहारिक सीमाओं कि उनकी उपयोगिता को कम सीमित है। इमेजिंग फ्लो एक तकनीक है कि cytometry फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के इमेजिंग क्षमताओं के साथ प्रवाह की multiparametric मात्रात्मक शक्तियों को जोड़ती है। हमने हाल ही में एक इमेजिंग फ्लो दृष्टिकोण के उपयोग प्राप्तकर्ता टी कोशिकाओं दाता प्रतिजन-प्रस्तोता कोशिकाओं (APCs) के साथ परिपक्व प्रतिरक्षा synapses बनाने में सक्षम के अनुपात में परिभाषित करने के लिए बनाया है। एक अच्छी तरह से विशेषता माउस हृदय प्रत्यारोपण मॉडल का उपयोग करना, हम पता चला है कि टी एपीसी membr के बीच इन विट्रो प्रतिरक्षा synapses की आवृत्तिane संपर्क घटनाओं दृढ़ता से अस्वीकृति, सहिष्णुता में allograft परिणाम है, और एक स्थिति है जहाँ प्रत्यारोपण अस्तित्व प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं पर निर्भर करता है की भविष्यवाणी की। टी एपीसी संपर्कों की आवृत्ति तीव्र अस्वीकृति के दौरान चूहों से टी कोशिकाओं के साथ वृद्धि हुई है और alloantigen का जवाब नहीं देता गाया चूहों से टी कोशिकाओं के साथ की कमी हुई। इन विट्रो प्रणाली के लिए विनियामक टी कोशिकाओं के अलावा लंबे समय तक टी एपीसी संपर्क कम कर दिया। गंभीर, इस आशय भी विस्तार मानव polyclonally साथ देखा गया था स्वाभाविक रूप से विनियामक टी कोशिकाओं है, जो मानवीय माउस मॉडल में मानव ऊतकों की अस्वीकृति को नियंत्रित करने के लिए जाने जाते हैं होने वाली। इस दृष्टिकोण के आगे विकास के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में alloreactive टी सेल डिब्बे की एक गहरी लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दे सकता है। भविष्य में, आगे के विकास और इस विधि मानव कोशिकाओं का उपयोग कर के मूल्यांकन प्रतिरक्षादमन न्यूनीकरण के लिए रोगियों का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता assays के लिए आधार के रूप में हो सकता है, और यह tolerogen के प्रभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताआईसी क्लिनिक में उपचार।
ठोस अंग प्रत्यारोपण गुर्दे, जिगर, हृदय और फेफड़ों के अंतिम चरण में रोगों के साथ रोगियों की देखभाल बदल गया है। बड़ी और छोटी उतक अनुरूपता एंटीजन में असमानताओं के कारण, तथापि, allografts तुरंत प्राप्तकर्ता टी कोशिकाओं द्वारा अस्वीकार किए जाते हैं, तो प्रतिरक्षा को दबाने वाली दवाओं का प्रयोग नहीं किया जाता है। ये एजेंट कैंसर और अंग में शिथिलता के लिए जोखिम सहित कई प्रतिकूल प्रभाव है। एक प्रमुख नैदानिक लक्ष्य allograft अस्वीकृति को रोकने के लिए आवश्यक न्यूनतम स्तर तक प्रतिरक्षादमन की खुराक कम करने के लिए इसलिए है। इस स्तर पर सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण की डिग्री के आधार पर भिन्न होने की संभावना है; दाता प्राप्तकर्ता alloantigen बेमेल की डिग्री; और प्रतिरक्षा समारोह, फार्माकोकाइनेटिक्स और pharmacodynamics में अंतर-रोगी मतभेद।
दुर्भाग्य से, प्रत्यारोपण चिकित्सकों सही रूप में व्यक्तिगत रोगियों 1 में दाता प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए किसी भी उपकरण नहीं है। मिश्रितल्युकोसैट प्रतिक्रिया (एमएलआर) दाता प्रतिक्रियात्मकता का पता लगा सकते हैं, लेकिन यह मज़बूती से भ्रष्टाचार परिणाम 2, 3 की भविष्यवाणी करने में विफल रहता है। सीमित कमजोर पड़ने assays, साइटोकाइन ELISPOTs, और ट्रांस-विवो परख या तो प्रतिक्रियाओं की एक सीमित रेंज को मापने या व्यावहारिक परिचालन सहिष्णुता 9, 10, 11 से संबंधित 4, 5, 6, 7, 8 .Gene अभिव्यक्ति प्रोफाइल से पता चला है हस्ताक्षर नहीं कर रहे हैं, 12 और अस्वीकृति 13, 14, 15, लेकिन ये हमेशा आबादी 16 के पार generalizable नहीं हैं और अंत में अलग-अलग रोगियों में उपयोगिता सीमित हो सकता है। अनुक्रम आधारित analyपरिधीय रक्त 17 या proliferating में टी सेल रिसेप्टर (TCR) एमएलआर 18 में टी कोशिकाओं की की सत्र भी विकसित किया गया है, लेकिन आगे सत्यापन की आवश्यकता।
वैचारिक रूप से, यह एक परख है कि एक दाता प्रतिजन द्वारा प्राप्तकर्ता टी सेल सक्रियण में जल्द से जल्द आवश्यक चरणों का पता लगाता है के लिए वांछनीय होगा। दिनों में कोशिकाओं संवर्धन (एमएलआर के रूप में) कलाकृतियों लागू कर सकते हैं के बाद से, इस तरह के एक परीक्षण आदर्श रूप में इस तरह के प्रसार या प्रेरक क्रिया के रूप में नीचे की ओर की घटनाओं, के माप की आवश्यकता नहीं होगी। समान रूप से, तथापि, यह भी वांछनीय के लिए परीक्षण विशुद्ध रूप से वर्णनात्मक आकलन के बाद से टी सेल समारोह के कुछ तत्व पर निर्भर रहना, होगा (जैसे, TCR अनुक्रमण) anergic और कार्यात्मक टी कोशिकाओं के बीच भेद करने में असमर्थ हो सकता है।
कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि लंबे समय तक टी एपीसी संपर्क एक प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन के गठन, जो एक आवश्यक पहला है के लिए आवश्यक हैटी सेल प्रतिक्रिया 19, 20, 21, 22 में कदम। हमने हाल ही में खबर दी है कि, इन विट्रो समय चूक इमेजिंग, के बारे में 5 में गतिशील दौरान – माउस का 10% सीडी 4+ टी कोशिकाओं अनुवांशिक रूप से भिन्न अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDCs) 23 के साथ लंबे समय से स्थायी संपर्क के रूप में। लंबे समय तक संपर्क की आवृत्ति कि जानवरों, एक भ्रष्टाचार को अस्वीकार कर दिया है, जबकि चूहों में पहले से ही एंटीजन को सहिष्णु गाया में वृद्धि की गई थी, यह untransplanted चूहों 23 में देखा स्तर पर बने रहे। लंबे समय तक बातचीत प्राप्तकर्ता Tregs की उपस्थिति में कम हो गई थी और उनकी अनुपस्थिति में वृद्धि हुई है, और हम मानव टी कोशिकाओं और अनुवांशिक रूप से भिन्न monocyte व्युत्पन्न डीसी (MoDCs) 23 का उपयोग करते हुए समान घटना मनाया।
हालांकि, लंबे समय तक संपर्क का गणन एक पॉलीक्लोनल टी सेल populatio के भीतर कियाn समय लेने वाली और श्रम प्रधान है। इसलिए हम प्रवाह cytometry इमेजिंग के उपयोग के अनुवांशिक रूप से भिन्न प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन जांच करने के लिए बनाया है। इमेजिंग फ्लो cytometry प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के एकल सेल इमेजिंग क्षमताओं के साथ पारंपरिक प्रवाह की multiparametric डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण क्षमताओं को शामिल किया गया। इस तकनीक को अन्य जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है मोनोक्लोनल टी कोशिकाओं 24, 26, 27 या 28 superantigens की उपस्थिति में प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन का अध्ययन करने के। जैसे सेटिंग में, हालांकि, जवाब टी कोशिकाओं की आवृत्ति 30-100% से पर्वतमाला alloreactive टी कोशिकाओं आम तौर पर कुल टी सेल प्रदर्शनों की सूची 29, 30, 31, 32 के 5-15% का प्रतिनिधित्व करने का अनुमान है, जबकि। महत्वपूर्ण रूप से, हम पता चला है कि इमेजिंग फ्लो av उत्पादन कर सकते हैंery alloreactive टी सेल आवृत्ति 23 की और कहा कि एक पॉलीक्लोनल टी सेल आबादी के भीतर अन्तर्ग्रथन आवृत्ति में परिवर्तन भ्रष्टाचार परिणाम 23 की भविष्यवाणी कर रहे हैं तुलनीय उपाय। वर्तमान में, इस दृष्टिकोण सीडी 4+ टी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष alloreactivity को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन, सिद्धांत रूप में, यह भी CD8 + टी कोशिकाओं और अप्रत्यक्ष मार्ग की जांच के लिए विकसित किया जा सकता। अप्रत्यक्ष alloreactivity लम्बे समय के बाद प्रत्यारोपण 33 पर तेजी से प्रासंगिक हो माना जाता है। वर्तमान में हम मानव कोशिकाओं है, जो रोगियों में परीक्षण के लिए अनुमति देगा का उपयोग करने के लिए इस विधि विकसित कर रहे हैं। इस प्रकार, भविष्य में, समग्र दृष्टिकोण प्रत्यारोपण से पहले प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में टी सेल प्रतिक्रियाओं के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता है; तुरंत प्रत्यारोपण के बाद; और लंबी अवधि में, जब दवा न्यूनतम एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन जाता है।
इमेजिंग फ्लो मोनोक्लोनल टी कोशिकाओं और APCs के बीच या superantigens 24, 25, 26, 27, 28 की उपस्थिति में प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन गठन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस विधि तथ्य यह है कि एक उत्पादक टी सेल-एपीसी संपर्क के बाद, टी सेल अपने actin cytoskeleton rearranges, संपर्क 21 के स्थल की ओर ध्रुवीकरण का लाभ लेता है। यह पुनर्व्यवस्था TCR संकेत के बिना नहीं होती है, और इसलिए यह टी सेल सक्रियण 19, 20, 21 का एक प्रारंभिक सहसंबंधी है। यहाँ प्रस्तुत विधि पॉलीक्लोनल टी सेल आबादी में alloreactive टी सेल आवृत्ति की माप के लिए इस दृष्टिकोण adapts। इस प्रकार, यह भविष्य में दाता reactivi के लिए assays के विकास के लिए आधार के रूप में सेवा कर सकता है नैदानिक प्रत्यारोपण में Ty।
हालांकि सीधे तुलना अभी तक नहीं बनाया गया है, alloreactive प्रतिरक्षा synapses का पता लगाने के पारंपरिक एमएलआर की तुलना में बेहतर भविष्यवाणी करने की शक्ति प्रतीत होता है। उदाहरण के लिए, पिछले काम, पता चला है कि में tolerizing प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित है, एक एमएलआर के परिणामों मज़बूती से भ्रष्टाचार परिणाम 2 के साथ संबंध स्थापित करने के लिए असफल।
Assays के एक नंबर, मनुष्य 9, 10, 11 में प्रचालन सहिष्णु राज्य के लिए विकसित किया गया है, हालांकि इन alloantigen के जवाब में प्रेरक सेल की कार्यक्षमता की माप नहीं है। इसके विपरीत, IFNγ ELISPOT 8 उपाय प्रेरक टी सेल समारोह assays लेकिन इस तरह के आईएल 17 38 के रूप में साइटोकाइन स्राव के पूरे स्पेक्ट्रम कि तीव्र और जीर्ण allograft अस्वीकृति के लिए प्रासंगिक हो सकता है, पर कब्जा नहीं कर सकते हैं,> 39। सीमित कमजोर पड़ने परख 4, जो श्रम गहन है, और ट्रांस विवो परख 6, जो चूहों की आवश्यकता है, महत्वपूर्ण व्यावहारिक सीमाओं कि एक नैदानिक सेटिंग में अपने आवेदन में बाधा आएगी है। एमएलआर में जवाब टी कोशिकाओं की TCR अनुक्रम विश्लेषण का उपयोग proliferating कोशिकाओं के विश्लेषण पर हाल ही के सुधार मूल्य का हो सकता है लेकिन यहां प्रस्तुत परख की तरह, नैदानिक अध्ययन 18 में आगे सत्यापन की आवश्यकता होगी, 40।
प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन का पता लगाने परख के आगे विकास की आवश्यकता होगी कि महत्वपूर्ण सवाल का जवाब दिया जा। सबसे पहले, परख के रूप में विकसित केवल प्रत्यक्ष alloreactivity को मापता है। प्रत्यक्ष मार्ग दाता व्युत्पन्न APCs पर अनुवांशिक रूप से भिन्न एमएचसी / पेप्टाइड परिसरों की प्रस्तुति शामिल है। बाद आम तौर पर जल्दी से प्रत्यारोपण के बाद समाप्त हो जाते हैं, और आगे alloantigen प्रस्तुति carri हैबरकरार दाता एमएचसी (अर्द्ध सीधा मार्ग) पेश प्राप्तकर्ता APCs या स्वयं एमएचसी (अप्रत्यक्ष मार्ग) पर कार्रवाई की दाता एंटीजन से बाहर एड। अप्रत्यक्ष मार्ग पुरानी allograft अस्वीकृति 33, 41 का एक महत्वपूर्ण ड्राइवर है।
सिद्धांत रूप में, यह इस परख का उपयोग कर अप्रत्यक्ष प्रतिरक्षा synapses पता लगाने के लिए संभव होना चाहिए, लेकिन परोक्ष रूप से alloreactive टी कोशिकाओं प्रत्यक्ष वाले 42, 43 की तुलना में काफी कम आवृत्ति है, जिसका अर्थ है कि घटनाओं की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। एक दूसरा विचार यह है कि हम केवल सीडी 4+ टी कोशिकाओं का उपयोग कर, जबकि सीडी 8+ टी कोशिकाओं में भी विरोधी दाता प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक हैं इस परख का परीक्षण किया है है। फिर, यह इस पद्धति का उपयोग सीडी 8+ टी सेल एपीसी synapses पता लगाने के लिए संभव हो जाना चाहिए। एक और सीमा यह है कि विधि अंतिम memb में मैन्युअल समीक्षा और सेल छवियों के विश्लेषण की आवश्यकता हैराणे संपर्क फाटक, और हम वर्तमान में इस कदम के स्वचालन पर काम कर रहे हैं।
अंत में, विधि मानव विषयों में परीक्षण और विकास की आवश्यकता है, और मानव नमूनों के साथ प्रारंभिक पढ़ाई वर्तमान में किया जा रहा है। प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में प्रतिरक्षा synapses का पता लगाने के साथ आगे प्ररूपी टी सेल सबसेट विश्लेषण (यानी, प्रेरक, स्मृति, नियामक, आदि) संयोजन में alloreactive टी सेल प्रदर्शनों की सूची की विशेषताओं के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं और के लिए एक महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित किया जाएगा भविष्य का कार्य।
The authors have nothing to disclose.
SCJ दिल के लिए एक इंटरनेशनल सोसायटी और फेफड़ों प्रत्यारोपण रिसर्च फेलोशिप और चिकित्सकों की एक रॉयल कॉलेज और कनाडा Detweiler Fellowship.SM यात्रा के सर्जन द्वारा समर्थित किया गया हृदय और फेफड़ों प्रत्यारोपण कैरियर के विकास के पुरस्कार (SCJ करने के लिए) के लिए एक इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा भाग में समर्थित किया गया। एसएस स्वास्थ्य अनुसंधान ऑक्सफोर्ड जैव चिकित्सा अनुसंधान Centre.JH के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया एक गुर्दा रिसर्च यूके वरिष्ठ गैर क्लीनिकल फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है। एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम अनुदान (082519Z07Z), एक ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन कार्यक्रम अनुदान (पीजी / 10 / ६२.२८,५०४), और यूरोपीय संघ फ्रेमवर्क कार्यक्रम 7 (; BioDRIM एक अध्ययन): यह काम एबी और किलोवाट के लिए निम्न अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखकों ImageStream मार्क X साधन के साथ करने के लिए उपयोग और समर्थन प्रदान करने के लिए माइकल पार्सन्स और Lunenfeld-Tanenbaum रिसर्च इंस्टीट्यूट में फ्लो Cytometry कोर सुविधा, सिनाई स्वास्थ्य प्रणाली, टोरंटो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Phosphate-buffered saline | Various | Varies | |
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Triton X-100 nonionic detergent | Sigma-Aldrich | X100 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution |
Cell strainers, 70 μm pore size | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P5282 | |
7-aminoactinomycin D | Thermo Fisher Scientific | A1310 | Reconstitute in DMSO |
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 | eBioscience | 17-0902 | |
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b | eBioscience | 48-0112 | Pacific blue has been replaced by eFluor 450 |
Biotinylated anti-mouse CD3 | eBioscience | 13-0032 | |
Biotinylated anti-mouse MHC class II | eBioscience | 13-5321 | |
Biotinylated anti-mouse B220 | eBioscience | 13-0452 | |
Biotinylated anti-mouse CD8 | eBioscience | 13-0081 | |
Biotinylated anti-mouse CD19 | eBioscience | 13-0193 | |
Anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS magnetic cell separator | MIltenyi Biotec | 130-042-302 | |
recombinant mouse GM-CSF | Peprotech | 315-03 | |
recombinant human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | Human TGFβ1 has activity on mouse cells |
Amnis ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/ |
IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20 |
Cell culture medium | Various | Varies | |
Fetal bovine serum | Various | Varies | |
Cell culture plates | Various | Varies |