Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

Published: April 19, 2017 doi: 10.3791/55283
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 4
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute, University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute, University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital, University of Oxford

Summary

وتصف هذه الورقة طريقة لقياس alloreactivity في يسكنها خليط من الخلايا T باستخدام التدفق الخلوي التصوير.

Abstract

ومن المرجح أن تكون حاسمة للحد ناجحة أو سحب المناعة قياس تفاعل مناعي لمستضدات المانحة في متلقى. كانت جميعها تطبيق ردود فعل متباينة الكريات البيض (MLR)، والحد المقايسات التخفيف، وعبر الجسم الحي من نوع تأخر فرط الحساسية (DTH) فحص على هذا السؤال، ولكن هذه الأساليب لها قدرة محدودة على التنبؤ و / أو القيود العملية الهامة التي تقلل من فائدتها. تدفق التصوير الخلوي هو الاسلوب الذي يجمع بين القوى الكمية multiparametric من التدفق الخلوي مع قدرات التصوير المجهري الفلورسنت. التي قطعناها على أنفسنا في الآونة الأخيرة استخدام نهج التدفق الخلوي التصوير لتحديد نسبة المتلقي T خلايا قادرة على تشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعي ناضجة مع الجهات المانحة الخلايا المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). باستخدام الماوس نموذج زرع قلب تتميز بشكل جيد، ونحن قد أظهرت أن وتيرة في المختبر نقاط الاشتباك العصبي المناعي بين T-APC membrوتوقع الأحداث انو الاتصال بقوة نتيجة المزروع في الرفض، والتسامح، والحالة التي يكون فيها يعتمد بقاء الزرع على خلايا T التنظيمية التي يسببها. زادت وتيرة الاتصالات T-APC مع خلايا T من الفئران خلال الرفض الحاد وانخفض مع خلايا T من الفئران المقدمة لا تستجيب لمستضد خيفي. إضافة خلايا T التنظيمية للنظام في المختبر خفضت طويلة الاتصالات T-APC. الأهم من ذلك، كان ينظر إلى هذا تأثير أيضا مع polyclonally الإنسان الموسعة، التي تحدث بشكل طبيعي خلايا T التنظيمية، والتي تعرف للسيطرة على رفض الأنسجة البشرية في نماذج الماوس أنسنة. مواصلة تطوير هذا النهج قد تسمح لتوصيف أعمق للمقصورة تي خلية alloreactive في متلقى. في المستقبل، ومواصلة تطوير وتقييم هذه الطريقة باستخدام خلايا الإنسان قد تشكل أساسا لفحوصات المستخدمة لتحديد المرضى لتقليل المناعة، ويمكن استخدامه لقياس تأثير مولد التحملجيم العلاج في العيادة.

Introduction

حولت زرع الأعضاء الصلبة رعاية المرضى الذين يعانون من أمراض في نهاية المرحلة في الكلى والكبد والقلب والرئتين. ونظرا إلى التفاوت في مستضدات التوافق النسيجي الرئيسية والثانوية، ومع ذلك، يتم رفض ال allografts على الفور من قبل خلايا T المتلقي إذا لم يتم استخدام الأدوية المثبطة للمناعة. هذه العوامل لها العديد من الآثار السلبية، بما في ذلك مخاطر الإصابة بالسرطان وضعف الجهاز. لذا، فإن الهدف الرئيسي هو سريري لخفض جرعة من المناعة إلى مستوى الحد الأدنى المطلوب لمنع رفض المزروع. ومن المرجح أن تختلف تبعا لدرجة تفعيل نظام المناعة الفطري هذا المستوى. درجة عدم تطابق مستضد خيفي المانح والمتلقي. والاختلاف بين المريض في وظائف المناعة، الدوائية، والدوائية.

للأسف، الأطباء زرع ليس لديهم أي أدوات لتقييم بدقة التفاعل المانحة في مريض 1. مختلطةرد فعل الكريات البيض (MLR) يمكن الكشف عن تفاعل الجهات المانحة، لكنها فشلت في التنبؤ بشكل موثوق الكسب غير المشروع النتيجة 2 و 3. الحد المقايسات التخفيف، ELISPOTs خلوى، وفحص عبر الجسم الحي إما تقيس مجموعة محدودة من الاستجابات أو ليست عملية التوقيعات 4، 5، 6، 7، 8 ملامح التعبير .Gene كشفت المتعلقة التسامح التشغيلي 9، 10، 11، 12 ورفض 13، 14، 15، ولكن هذه ليست دائما للتعميم عبر السكان 16 و في نهاية المطاف قد حدت من فائدة في مريض على حدة. analy القائم على التسلسلكما وضعت إس إي إس من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) خلايا T في الدم المحيطي 17 أو المتكاثرة في MLR 18 ولكن تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة.

من الناحية النظرية، يستحسن أن يكون هناك فحص يكشف عن أقرب الخطوات المطلوبة في المتلقي تي خلية التنشيط بواسطة المستضد المانحة. منذ زراعة الخلايا خلال الأيام (كما في MLR) يمكن أن يعرض القطع الأثرية، فإن مثل هذا الاختبار من الناحية المثالية لا يتطلب قياس الأحداث المصب، مثل انتشار أو وظيفة المستجيب. وبالمثل، ومع ذلك، فإنه من شأنه أيضا أن يكون من المرغوب فيه للاختبار ليعتمد على بعض العناصر من وظيفة الخلايا التائية، منذ تقييم وصفية بحتة (على سبيل المثال، TCR التسلسل) قد تكون غير قادر على التمييز بين الخلايا T التعطيلي والوظيفية.

وقد أشارت العديد من الدراسات إلى أن فترات طويلة T-APC الاتصال مطلوب من أجل تشكيل المشبك المناعي، وهو أول شيء أساسيخطوة في استجابة خلايا T 19، 20، 21، 22. بلغنا مؤخرا أنه خلال ديناميكية في المختبر التصوير الفاصل الزمني، حوالي 5 - 10٪ من الماوس خلايا CD4 + T تشكل الاتصالات طويلة الأمد مع العظم خيفي الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع (BMDCs) 23. وزادت وتيرة الاتصال لفترات طويلة في الحيوانات التي رفضت الكسب غير المشروع، في حين أن الفئران المقدمة سابقا تسامحا لنفس مستضدات، إلا أنها ظلت في مستويات لم تشهدها في الفئران untransplanted 23. تم تخفيض التفاعلات لفترات طويلة في وجود المتلقي Tregs وزيادة في غيابهم، ونحن لاحظ ظواهر مماثلة باستخدام خلايا T الإنسان وخيفي البلدان النامية المشتقة من الوحيدات (MoDCs) 23.

ومع ذلك، فإن تعداد الأسماء المطولة يتخذ خلال populatio بولكلونل T-خليةn غير مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. لذا قدمنا ​​استخدام التصوير تدفق الخلوي لفحص خيفي تشكيل المشبك المناعي. تدفق التصوير يتضمن الخلوي في الحصول على البيانات وقدرات التحليل multiparametric تدفق التقليدية الخلوي مع قدرات التصوير وحيدة الخلية المجهر مضان. وقد استخدمت هذه التقنية من قبل باحثين آخرين لدراسة تشكيل المشبك المناعي عن طريق خلايا T وحيدة النسيلة 24، 26، 27 أو في وجود مستضد فوقي 28. في مثل هذه الأوضاع، ولكن وتيرة الاستجابة خلايا T تتراوح 30-100٪، في حين تقدر alloreactive خلايا T عموما لتمثيل 5-15٪ من مجموع خلايا T ذخيرة 29، 30، 31، 32. الأهم من ذلك، أننا أظهرنا أن التدفق الخلوي التصوير يمكن أن تنتج مركباتريها تدبير مماثل من alloreactive تردد T-خلية 23 وأن التغيرات في وتيرة المشبك داخل بولكلونل السكان T-الخلية هي التنبؤية لنتائج الكسب غير المشروع 23. حاليا، وقد تم تحسين هذا النهج لقياس alloreactivity مباشرة من خلايا CD4 + T، ولكن، من حيث المبدأ، ويمكن أيضا أن تكون وضعت لفحص خلايا CD8 + T ومسار غير مباشر. ويعتقد alloreactivity غير مباشرة لتصبح ذات الصلة على نحو متزايد في أوقات أطول في مرحلة ما بعد زراعة 33. نقوم حاليا بتطوير هذه الطريقة لاستخدام الخلايا البشرية، والتي سوف تسمح للاختبار في المرضى. وهكذا، في المستقبل، قد يكون من المفيد النهج العام للتقييم وظيفي الردود T-خلية في متلقى قبل الزرع. مباشرة بعد الزرع. وعلى المدى الطويل، وعندما يصبح الحد المخدرات هدفا مهما.

Protocol

1. إعداد الكواشف والمواد المطلوبة

  1. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) ( "غسل العازلة"). إعداد برنامج تلفزيوني مع 2٪ FCS تحتوي على منظفات غير أيوني 0.1٪ ( "عازلة بيرم غسل"، وانظر جدول المواد). إعداد برنامج تلفزيوني مع 1.5٪ الفورمالديهايد.
    ملاحظة: تحذير! الفورمالديهايد هو تآكل ويحتمل أن تكون مسببة للسرطان، ويجب أن يتم التعامل معها في حين يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
  2. إعداد PBS تحتوي على 2٪ FBS و 0.5 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لفصل الخلايا المغناطيسية ( "عازلة MCS").
  3. تجهيز 50 ميكروغرام / مل-phalloidin فلوريسئين ثيوسيانات (Phalloidin-FITC) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). إعداد 1 ملغ / مل وصمة عار النووية (على سبيل المثال 1 ملغ / مل 7 aminoactinomycin D (7-AAD) في DMSO أو مكرر benzimide صبغ، وانظر جدول المواد) في DMSO. إعداد الأجسام المضادة المسمى تألقي يتناسب مع خلايا الفائدة والتصوير تدفق عداد الكريات.
  4. الحصول على الأنسجة الحيوانية (على سبيل المثال، والعقد اللمفاوية والطحال) كمصدر للخلايا T والأنسجة الحيوانية خيفي (على سبيل المثال، الطحال ونخاع العظام) كمصدر للخلايا المقدمة للمستضد أو الأسلاف.
  5. إعداد خلية ثقافة المتوسط (على سبيل المثال، معهد روزويل بارك التذكاري المتوسطة (RPMI) 1640 أو Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS)، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، البنسلين، والستربتومايسين والحصول على 24- و / أو 96- جيدا لوحات زراعة الخلايا.

2. إعداد الخلايا مستضد تقديم

ملاحظة: من الناحية النظرية، يمكن دراسة أية مجموعة من السكان APC مع هذا الأسلوب. الماوس العظام خلايا غير ناضجة المشتقة من نخاع الجذعية (DCS) حيث تم رفع دعوى ضد ناقلات الجنود المدرعة في هذه الحالة. وتوجد العديد من البروتوكولات لتوليد هذه الخلايا (على سبيل المثال، المراجع 34 و 35). لفترة وجيزة، تم استخدام بروتوكول التالي.

  1. نخاع دافق من عظام الفخذ وtibias إلى RPMI 1640 أو DMEM.
  2. تمر الخلايا مع وقف التنفيذ من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لإزالة قطع صغيرة من العظم والحطام.
  3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي ثم ليز خلايا الدم الحمراء باستخدام عازلة كلوريد الأمونيوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق) وإعادة تعليق بيليه الخلية.
  5. غسل الخلايا في 5-10 مل من غسل العازلة، بيليه بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق)، وإعادة تعليق بيليه الخلية.
  6. نمي السلائف المكونة للدم على عمود فصل الخلية التي وصفها الخلايا مع المعقدة البيروكسيديز مكافحة CD3 (5 ميكروغرام / مل)، ومكافحة B220 (5 ميكروغرام / مل)،-MHC المضادة من الدرجة الثانية (1 ميكروغرام / مل)، ومكافحة CD11b (5 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة.
  7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق) وإعادة تعليق بيليه الخلية.
  8. احتضان الخلايا مع ميكروبيدات المغناطيسية المضادة للالبيوتين (انظر الجدول المواد) في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  9. غسل وبيليه الخلايا (400 x ج، 5 دقائق) وإعادة السقوفد لهم في 1 مل من MCS المخزن المؤقت قبل إزالة الخلايا المسمى باستخدام مجموعة مختارة إيجابية كبيرة (LS) المغناطيسي عمود فصل خلية تستعد مع 3 مل من العازلة MCS ووضعها في المغناطيس لها. غسل العمود 3 مرات مع 3 مل من العازلة MCS. سوف تحتوي على التدفق من خلال الخلايا المطلوبة.
  10. ثقافة الخلايا التي تمر عبر عمود لمدة 6 أيام في RPMI 1640 أو DMEM تستكمل مع 2 نانوغرام / مل المؤتلف الماوس محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) و 2 نانوغرام / مل من المؤتلف β1 عامل النمو التحويلي الإنسان (TGFβ1) . استبدال نصف المتوسط ​​كل يوم 2 مع المتوسطة كاملة الطازجة التي تحتوي على 2 نانوغرام / مل GM-CSF وTGFβ1.
    ملاحظة: TGFβ1 الإنسان لديها النشاط في خلايا فأر. تم إنشاء البيانات باستخدام هذه البلدان النامية غير ناضجة. خلايا أخرى (على سبيل المثال، B الخلايا والبلدان النامية ناضجة) قد تكون مناسبة كما ناقلات الجنود المدرعة ولكن لم يتم اختبارها في هذا الاختبار.
  11. Cryopreserve البلدان النامية في 90٪ مصل / 10٪ DMSO وتخزينها في النيتروجين السائل. استعادة علىيوم استخدام. قبل الاستخدام، وحساب عدد من البلدان النامية قابلة للحياة في عدادة الكريات باستخدام استبعاد التريبان الأزرق. إعادة تعليق بيليه خلية في مستنبت في الكثافة المناسبة (راجع الخطوة 4.1) قبل استخدامها في القسم 4.

3. إعداد T خلايا

  1. استخدام طرق اختيار السلبية لتجنب دون قصد نقل تفعيل أو المثبطة إشارات إلى الخلايا.
    ملاحظة: في هذا المثال، يتم إعداد خلايا CD4 + T لتحليلها.
    1. لإعداد خلايا CD4 + T من الطحال الماوس، الهريس والطحال من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر باستخدام المكبس من حقنة. غسل مصفاة الخلية مع غسل العازلة.
    2. بيليه الخلايا مع وقف التنفيذ عن طريق الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق) ثم ليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة تعليق بيليه في عازلة كلوريد الأمونيوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق) وإعادة تعليق بيليه.
    4. غسل الخليةالصورة في 5-10 مل من غسل العازلة وبيليه بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق). إعادة تعليق بيليه.
    5. وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز إلى CD8، كبرى التوافق النسيجي الطبقة معقدة II (MHC II، 1 ميكروغرام / مل)، وCD19 (5 ميكروغرام / مل). احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. غسل الخلايا في 10 مل من غسل العازلة وبيليه بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق). إعادة تعليق بيليه.
    7. احتضان الخلايا مع ميكروبيدات المغناطيسية المضادة للالبيوتين (انظر الجدول المواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    8. غسل الخلايا في 10 مل من غسل العازلة وبيليه بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق)؛ إعادة تعليق بيليه.
    9. اعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة MCS وإثراء خلايا CD4 + T على عمود فصل الخلية المغناطيسي تستعد مع 3 مل من MCS عازلة على المغناطيس. غسل العمود 3 مرات مع 3 مل من العازلة MCS. سيحتوي العمود التدفق من خلال خلايا T المخصب.
  2. بواسطة cytome تدفق معيارمحاولة، وتقييم الخلايا التائية النقاء باستخدام قسامة من الخلايا المحددة سلبا. وصمة عار على الخلايا باستخدام المترافقة-تألقي streptavidin (لتحديد أي الخلايا المسمى البيوتين التي كان ينبغي أن أزيلت على العمود)، والأجسام المضادة أو الأجسام المضادة للتعرف على السكان T-خلية من الفائدة (CD4 في هذه الحالة). نقاء ≥85٪ مقبول 23.
    1. عد الخلايا T في عدادة الكريات التي كتبها استبعاد التريبان الأزرق (≥90٪ الجدوى غير مقبول).
      ملاحظة: يحتوي عازلة MCS EDTA، والتي يجب إزالتها قبل الفحص. ولتحقيق ذلك، بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (400 x ج، 5 دقائق) ويغسل في 1 مل من غسل العازلة. بيليه الخلايا مرة أخرى (400 x ج، 5 دقائق) واعادة تعليق في مستنبت في الكثافة المناسبة (راجع الخطوة 4.1).

4. المشارك احتضان خلايا T والبلدان النامية

  1. البذور خلايا T والبلدان النامية في 2: 1 T: نسبة DC في 24 جيدا أو 96-جيدا لوحة الثقافة الخلية. ضمان حجم الثقافة النهائي هو ≤500 ميكرولتر ل24 لوحات جيدا أو ≤50 ميكرولتر لوحات 96-جيدا.
    ملاحظة: أصغر أحجام تشجيع التفاعلات خلية خلية وتسمح مساحة لعازلة تثبيت لاحق.
    1. ضبط أعداد الخلايا الدقيقة تجريبيا، ولكن كدليل عام، استخدم 1 × 10 6 خلايا تي و 0.5 × 10 6 البلدان النامية لكل بئر (لوحة 96 أيضا). وينبغي النظر في هذه الأرقام الحد الأدنى من الخلايا، لأن استخدام خلايا أقل يجعل تعداد نقاط الاشتباك العصبي المناعي الصعبة.
      1. لزيادة أعداد الخلايا، وإنشاء الآبار تكرار وتجمع بعد الخطوة 5 (تثبيت).
        ملاحظة: عند إعداد الآبار تكرار، فإنه من المستحسن أن البذور البلدان النامية في جميع الآبار أولا ثم خلايا البذور T في كل من الآبار. هذا يقلل من التباين في فترة حضانة بين الآبار.
  2. احتضان لوحة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
e_title "> 5. إصلاح الخلايا في لوحة

  1. إضافة 3 أضعاف حجم ثقافة 1.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني على كل بئر ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ترينيداد وتوباغو المهم لإصلاح خلايا قبل إزالتها من لوحة للحد من اختلال التفاعلات خلية خلية.
  2. نقل الخلايا في لوحة في أنابيب لغسيل وتلطيخ لاحقة. في هذه المرحلة، جانبا خلايا إضافية لضوابط وصمة عار واحدة. وبصرف النظر عن هذه الضوابط، ينبغي ملطخة ثقافة كاملة مع كوكتيل الأجسام المضادة (راجع الخطوة 4.1.1).

6. خلايا وصمة عار

  1. خلايا وصمة عار في 100 ميليلتر من غسل العازلة التي تحتوي على مزيج من الأجسام المضادة تألقي مترافق المطلوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
    ملاحظة: يتضمن كوكتيل T محددة خلية وAPC محددة الأجسام المضادة. وينبغي اختيار Fluorochromes بحيث أنها يمكن تمييزها باستخدام التكوين من التصوير تدفق عداد الكريات. في تيانه التجارب هو موضح هنا، الزرقاء fluorophore مترافق CD11b (5 ميكروغرام / مل، انظر جدول المواد) وCD90.2 APC-مترافق (5 ميكروغرام / مل) استخدمت.
  2. غسل الخلايا في 1 مل من غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. صب وطاف. إعادة تعليق الخلايا في المخزن بيرم غسل تحتوي على phalloidin FITC في ،05-،5 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
    ملاحظة: تركيزات Phalloidin FITC نحو 0.1 ميكروغرام / مل تعمل بشكل جيد لخلايا فأر، ولكن من المتوقع أن تختلف من المورد، ونوع من الخلايا، والتصوير تدفق عداد الكريات تركيز مناسب.
  3. غسل الخلايا في 1 مل من بيرم / غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. صب وطاف. إعادة تعليق الخلايا في المخزن بيرم / غسل تحتوي على صبغة النووي في التركيز المناسب (على سبيل المثال، ما يقرب من 25 ميكروغرام / مل 7-AAD)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
  4. غسل الخليةالصورة في 1 مل من بيرم / غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. صب وطاف. غسل الخلايا مرة واحدة في غسل العازلة، بيليه، وإعادة تعليق في 50-100 ميكرولتر من غسل العازلة، ونقل الخلايا إلى صغيرة، أنابيب microcentrifuge توج.
  5. انتقل إلى الحصول على البيانات على الفور أو تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى عدة أيام قبل الحصول على التصوير تدفق عداد الكريات.
    تم تخزين خلايا بنجاح بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 7 أيام: ملاحظة. قد يكون التخزين الطويل ممكن ولكن لم يتم اختباره.

البيانات 7. اكتساب

  1. تهيئة وتكوين تدفق التصوير عداد الكريات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ضمان استقرار تدفق الأساسية قبل جمع أي بيانات.
  2. حجز قناة واحدة لشراء صورة brightfield. الحصول على البيانات ضبط وصمة عار واحدة مع قناة brightfield إيقاف تشغيل.
    1. انقر على زر "تحميل" وINSERT أنبوب يحتوي على عينة الملون بالكامل (عينة التي تم ملطخة جميع fluorochromes مطلوب) في حامل.
    2. في الإطار "مساحة عمل"، حدد وإنشاء مخطط التشتت جديد مع نسبة الارتفاع فوق المنطقة وبوابة فانلات حيث نسبة الارتفاع قريبة إلى 1. إنشاء مخطط التشتت جديد لكل قناة المستخدمة (شدة القناة في المحور الأفقي) .
    3. لكل تألقي، والتحقق من السكان إيجابي، وإذا لزم الأمر، وضبط الجهد ليزر في مربع "إضاءة".
    4. تفريغ الأنبوب وتحميل أول أنبوب واحد الملطخة.
    5. في مربع "إعدادات اقتناء"، اكتب اسم العينة وتعيين عدد من الأحداث التي يجب جمعها. إذا كان وصمة عار واحدة (للضوابط التعويض)، 1000 - 2000 الأحداث كافية.
    6. في مربع "قنوات"، اختيار القنوات التي تم ملطخة كل عينة مع. للضوابط وصمة عار واحدة، ويجب أن يتم تحديد جميع القنوات مع brightfدرع والجانب مبعثر قبالة. انقر على زر "سجل" تحت خانة "الاستحواذ". عندما يصل عدد من الأحداث عتبة معينة، وسوف يتوقف اكتساب تلقائيا.
    7. انقر على زر "العودة" لتفريغ الأنبوب. كرر الخطوات من 7.2.4 - 7.2.6 لكل عنصر تحكم وصمة عار واحدة. اعتمادا على عداد الكريات والبرمجيات، فإنه قد لا يكون من الممكن تعيين كافة البوابات هو مبين في الشكل (1) خلال الاستحواذ (أكثر يتم تنفيذ النابضة دقيقة أثناء التحليل؛ انظر القسم 8).
  3. الحصول على العينات وعينات واحدة الملطخة (في الخطوة 7.2)، ولكن في مربع "قنوات"، حدد كافة القنوات المطلوبة، بما في ذلك قناة brightfield.
    1. قبل تسجيل البيانات، والتحقق للتأكد من أن كثافة القناة المناسبة لتحديد السكان الخلية المطلوبة. إن لم يكن، وضبط إعدادات الليزر وإعادة تسجيل الضوابط وصمة عار واحدة باستخدام الإعدادات الجديدة، كما هو موضح في الخطوة 7.2.
    2. لكلالعينة، الحصول على عشرات الآلاف من الأحداث.
      ملاحظة: في معظم الظروف والأحداث خلية خلية الاتصال هي أقلية صغيرة من إجمالي عدد الخلايا (معظمها الخلايا واحد). بشكل عام، فمن المستحسن أن يكون على الأقل 100 الأحداث في بوابة غشاء اتصال النهائية.

8. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات المطلوبة على تدفق عداد الكريات التصوير باستخدام البرامج التحليلية المتاحة مجانا من موقع الشركة المصنعة (يجب إنشاء حساب مستخدم، وانظر جدول المواد).

شكل 1
الشكل 1. استراتيجية المحاصرة تستخدم لتحديد Alloreactive المناعي نقاط الاشتباك العصبي. A. في التركيز هي بوابات الأحداث من جميع الأحداث من خلال مراجعة الصور خلية تقوم على جذر متوسط مربع من معدل التغير في الصورة الشخصية للكثافة (التدرج RMS) باستخدام brightfield تشاننيل (قناة 4، Ch04)، كما هو موضح في النص. B. ومن بين الأحداث في التركيز، وتتميز الحلل من الخلايا واحد من قبل المتهم بالتآمر في نسبة الارتفاع مقابل منطقة القناة brightfield. تتجمع الخلايا واحدة على مقربة من نسبة الارتفاع من 1 وعلى مساحة صغيرة، في حين الحلل قريبة من 0.5 ولديهم مساحة أكبر. C. كثافة مضان من APC (في هذه الحالة، خلية الجذعية [DC] علامة، CD11c و) ثم يتم رسم مقابل كثافة مضان من علامة T-الخلية (في هذه الحالة، CD90.2)، وبوابات الأحداث الإيجابية مزدوجة. حدود بوابة يمكن صقلها من قبل استعراض الصور للأحداث القريبة من الحدود. ثم يتم تكريره الحلل D. T-APC بحيث تحتوي فقط على APC واحدا تلو بالتآمر نسبة الارتفاع مقابل منطقة علامة APC (CD11c و، CH02). ثم يتم تكريره الحلل E. هذه احد APC بحيث أنها تحتوي على خلايا T واحدة فقط من قبل المتهم بالتآمر في نسبة الارتفاع مقابل منطقةمن علامة T-الخلية (CD90.2، Ch06). F. وأخيرا، يتم اختيار الأحداث التي تحتوي على اثنين فقط من نوى بالتآمر رسم بياني لعدد بقعة على قناة وصمة عار النووية (7-AAD، Ch05) والنابضة الأحداث التي تحتوي على بقع 2-AAD إيجابية 7 فقط (أي نوى). ويتم تحليل الأحداث في هذه البوابة للاتصال الغشاء وتشكيل المشبك، كما هو موضح في الشكل (2). وقد تم تحليل البيانات بطريقة المعمى فيما يتعلق مهمة العلاج وهم من تجربة نشرت سابقا 23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: يتم وصف هذه الاستراتيجية النابضة في هذا القسم وصورت في الشكل 1. يجب أن يتم تنفيذ تحليل التدفق الخلوي التصوير البيانات بطريقة المعمى فيما يتعلق مهمة العلاج. على الرغم من أننا نعتقد أن نقاط الاشتباك العصبي المناعي وغير synapti-عموما ميزت الاتصالات ج بسهولة (انظر أدناه وأرقام 2 و 3)، المسببة للعمى يجب تقليل التحيز الناشئة عن الذاتية الكامنة في تحليل الصور.

  1. توليد مصفوفة التعويض عن طريق تحميل ملفات البيانات ضبط وصمة عار واحدة في المعالج التعويض. بعد تحميل ملفات واحد الملطخة، اختيار القنوات الفلورية المستخدمة في التجربة.
    ملاحظة: البرنامج تلقائيا بإنشاء مصفوفة التعويض، ولكن هذا يجب أن يتم التحقق من صحة يدويا لضمان أن تم اختيار السكان الإيجابي الصحيح.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق قيمة في المصفوفة وإضافة الرسم البياني إلى منطقة التحليل. إنشاء بوابة جديدة إذا لزم الأمر لاستبعاد أي خلية / الحلل / ايجابيات كاذبة الميتة. هذه الفئة من السكان إيجابي المكرر الجديد يمكن المحدد في مربع مصفوفة في القائمة المنسدلة لكل قناة أسفل.
    2. كرر ذلك لكل قناة. انقر على "إنهاء" لحفظ compensatioن المصفوفة (ملف .ctm).
  2. الحصول على ملف تحليل البيانات (.daf) من ملف الخام (.rif) عن طريق تحميل ملف .rif في برامج التحليل وتطبيق مصفوفة التعويض.
  3. مرة واحدة يتم تحميل البيانات، نفذ المعزولة لتحديد الأحداث الاتصال T خلية APC.
    ملاحظة: استراتيجية النابضة نموذجي يتضمن تحديد الأحداث في التركيز، واختيار الحلل بناء على معايير حجم (المنطقة مقابل نسبة أبعاد الحدث)، واختيار T الحلل خلية APC عن الأحداث التي هي إيجابية مضاعفة لT-الخلية و علامات APC (الشكل 1A-C).
    ملاحظة: نسبة الارتفاع هي نسبة عرض حدث إلى ذروته، والذي يسمح تمييز الخلايا واحدة (نسبة قريبة إلى 1) من الحلل (نسبة قريبة من 0.5).
  4. تحديد الأحداث في التركيز من قبل المتهم بالتآمر في جذر متوسط مربع من معدل التغير في ملف كثافة التصوير (RMS التدرج) في قناة brightfield (الشكل 1A). انقر على الالبريد التدرج RMS الرسم البياني لعرض الأحداث خلية في صناديق فردية ومن ثم وضع بوابة باستثناء الأحداث خارج نطاق التركيز.
  5. رسم المنطقة مقابل نسبة الارتفاع للقناة brightfield ورسم البوابة التي تحدد الحلل على أساس شكل الحدث وحجم (الشكل 1B). استعراض الصور للأحداث فقط داخل وخارج حدود هذه البوابة يمكن أن تساعد المحلل لتحسين حجم البوابة والموقف. ثم، بناء مؤامرة من هذه الأحداث صدرة التي تظهر كثافة الخلية علامة T على محور واحد ويبدو أن شدة علامة APC من جهة أخرى. رسم صدرة بوابة T-APC تحتوي على الأحداث الإيجابية لكل من علامات.
  6. ومن بين الأحداث صدرة T خلية APC، حدد الأحداث التي تحتوي فقط على الخلايا T واحد واحد APC.
    1. القيام بذلك عن طريق التآمر نسبة الارتفاع مقابل المنطقة لعلامة APC وتبوب على الحلل تحتوي على APC واحد (1D الشكل). مؤامرة نسبة الارتفاع مقابل منطقة للعلامة T-خليةإيه وبوابة على الحلل التي تحتوي على T خلية واحدة (الشكل 1E).
      ملاحظة: مزيد من الصقل يمكن أن يتحقق من خلال التآمر على الرسم البياني للدالة نقطة العد كما هو مطبق في مضان وصمة عار النووي والمعزولة على الأحداث مع اثنين فقط من البقع (الشكل 1F).
  7. في بعض الحالات، فإن الخلايا اثنين في صدرة لا تكون على اتصال. لتحديد الخلايا على اتصال مع بعضها البعض، وتحديد أقنعة وجوه لناقلات الجنود المدرعة وخلايا T.
    1. استخدام الخيار "أقنعة" في القائمة تحليل لفتح مدير أقنعة وتحديد قناع جديد. اكتب اسما، مثل "قناع الكائن T-الخلية." انقر فوق الزر "وظيفة"، ثم في مربع الحوار، اختر "كائن".
    2. حدد القناة التي يتم فيها الكشف عن علامة T-الخلية (على سبيل المثال، Ch06). انقر فوق موافق."
      ملاحظة: "كائن (M06، Ch06، ضيق)" يتم عرضها في مربع وظيفة. هذا القناع الكائن الافتراضي عادة العKS بشكل جيد ولكن قد تتطلب التحسين.
    3. كرر هذه العملية لإنشاء قناع الكائن APC في القناة المناسبة.
  8. بعد تحديد APC وخلايا T والأقنعة، وتحديد اتصال الغشاء بالتآمر T-خلية علامة كثافة مضان في قناع الكائن APC ضد كثافة مضان APC في قناع الكائن T-الخلية. في هذه المؤامرة، ورسم بوابة يتضمن خلايا فقط في الاتصال مع بعضها البعض.
    ملاحظة: عادة، هناك واضحة إلى حد ما السكان المزدوج إيجابي وسلبي المزدوج (الشكل 2A). الحدود بين السكان المزدوج الإيجابي والسلبي المزدوج يمكن تعيينها من قبل استعراض الصور brightfield من الخلايا في المنطقة الحدودية للتأكد من أن الخلايا في اتصال ضمن البوابة والتي يتم استبعاد الخلايا يست على اتصال.
  9. في هذه المرحلة، يدويا مراجعة phalloidin الصور FITC من الأحداث داخل هذه البوابة للتمييز نقاط الاشتباك العصبي المناعي ناضجة من بسيط خلية خلية الاتصال. Uحد ذاتها "بطاقة الصور" وظيفة للاحتفال هذه الصور.
    ملاحظة: النسبة المئوية من الأحداث الموسومة (نقاط الاشتباك العصبي المناعي) داخل هذه البوابة يمكن استخدامها بمثابة مؤشر للalloreactivity مباشرة في عدد السكان T-الخلية التي تجري دراستها.

Representative Results

وقد استخدم هذا الأسلوب لتحقيق CD4 + T alloreactivity الخلايا في الفئران المقدمة تسامحا لalloantigens المانحة قبل منتبذ زرع المزروع في القلب. أعطيت الفئران CBA (H-2 ك) بروتوكول tolerizing تتألف من المانحين محددة (B6، H-2 ب) نقل الدم جنبا إلى جنب مع غير المستنفدة CD4 الأجسام المضادة شهر واحد قبل الحصول على عملية زرع القلب B6. هذه النتائج البروتوكول في البقاء على قيد الحياة المزروع على المدى الطويل التي تعتمد على Foxp3 + الخلايا التائية التنظيمية 36 و 37. سبعة أيام بعد الزرع، وقد تم الحصول على الطحال خلايا CD4 + T من tolerized والمتلقين غير tolerized من ال allografts القلب B6 وكان شارك في حضنت مع B6 العظام البلدان النامية المشتقة من نخاع وفقا لهذا البروتوكول. ويبين الشكل 2 بيانات تمثيلية من هذه التجربة. يظهر بوابة غشاء الاتصال في الشكل 2A، مع مرمى الخضراء توضع على الحدث متشابك (اللوحة اليسرى، 1) وعلى حدث غير متشابك (اللوحة اليمنى). ويبين الشكل 2B في brightfield ومضان قنوات لهذا الحدث. للحد من التحيز، وقد تم تحليل البيانات بواسطة مراقب أعمى لاحالة المعاملة 23. كما هو مبين في العديد من الأمثلة في الشكل (3)، وكلاهما من غير tolerized- (الشكل 3A-B) وtolerized (الشكل 3C-D) المتلقين CBA القلوب B6، نقاط الاشتباك العصبي تتميز بسهولة من الاتصالات غير متشابك من خلال وجود سلسلة من التلال FITC إيجابية كثيفة في واجهة T-APC. وتشير هذه النتائج إلى أن الكشف البصري من نقاط الاشتباك العصبي المناعي التي أدلى بها خلايا T المتلقي يتابع مع درجة alloreactivity في المتلقي.

الشكل 2
الشكل 2. تحديد T-APC الحلل مع غشاءالاتصال والمناعة تشكيل المشبك. ويتم تحليل الأحداث في صدرة بوابة النهائية (الشكل 1F). يتم رسم A. مضان T-خلية علامة في قناع الكائن APC ضد APC مضان علامة في قناع كائن DC. بعض الأحداث صدرة لها APC وخلايا T من دون اتصال خلية خلية وتظهر في الزاوية السفلى اليسرى من مؤامرة (الصور لا تظهر). بوابة غشاء اتصال بالتالي يمكن استخلاص أن يشمل فقط الحلل فيها الخلايا T وناقلات الجنود المدرعة على اتصال. تتم مراجعة الصور من كل حدث في هذه البوابة عن أدلة على إعادة ترتيب الأكتين هيكل الخلية في القناة phalloidin-FITC ويمكن الموسومة باستخدام برنامج التحليل. وتشير اللوحة اليسرى حدث المشبك المناعي (المسمى 1 وأشار مرمى الخضراء)، في حين تشير اللوحة اليمنى حدث غشاء الاتصال دون تشكيل المشبك المناعي (المسمى 2 وأشار مرمى الخضراء). تحديد تشكيل المشبك يتطلب المراجعة اليدوية لهذهالصور، كما هو موضح في B. B. في الصف العلوي يظهر brightfield وقناة مضان الصور لصدرة مع المشبك المناعي (يتوافق مع الحدث 1 في A)؛ ويبين الصف السفلي صدرة مع اتصال الغشاء ولكن تشكيل تفتقر المشبك (يتوافق مع الحدث 2 في A). وقد تم تحليل البيانات بطريقة المعمى فيما يتعلق مهمة العلاج وهم من تجربة نشرت سابقا 23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. أمثلة من T-APC المشبك تشكيل. تلقت الفئران CBA ال allografts القلب من المانحين B6 بعد إما لا قبل المعالجة (AB) أو بعد تحريض التسامح مع الدم الكامل B6 تحت غطاء غير المستنفدة للالأجسام المضادة لمكافحة CD4 ( رونغ> CD). بعد 7 أيام، تم اختبار الطحال خلايا CD4 + T لتشكيل المشبك مع البلدان النامية B6. A. ثلاثة أمثلة من الحلل غير متشابك مع اتصال غشاء من حيوان غير tolerized. B. ثلاثة أمثلة من نقاط الاشتباك العصبي في مأمن من حيوان غير tolerized. C. ثلاثة أمثلة من الحلل غير متشابك مع اتصال غشاء من حيوان tolerized. D. ثلاثة أمثلة من نقاط الاشتباك العصبي في مأمن من الحيوانات tolerized. يشار إلى تشكيل المشبك عن طريق وجود مشرق، ريدج FITC إيجابية في واجهة T-APC (Ch03). وقد تم تحليل البيانات بطريقة المعمى فيما يتعلق مهمة العلاج وهم من تجربة نشرت سابقا 23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

آيس "> الأجسام المضادة / صبغ تألقي قناة تركيز CD11c و eF450 CH02 5 ميكروغرام / مل، يعاير تجريبيا CD90.2 APC Ch06 5 ميكروغرام / مل، يعاير تجريبيا Phalloidin FITC Ch03 0،05-،5 ميكروغرام / مل 7-AAD - Ch05 25 ميكروغرام / مل

الجدول 1. الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة في هذه الدراسة. يتم عرض الأجسام المضادة تألقي مترافق، والأصباغ والموردين وتركيزات الموصى بها في الجدول. يظهر تدفق التصوير عداد الكريات قناة التي تم استخدامها للكشف عن كل تألقي أيضا في الجدول.

Discussion

تدفق التصوير الخلوي قد استخدمت لإثبات تشكيل المشبك المناعي بين الخلايا T وحيدة النسيلة وناقلات الجنود المدرعة أو في وجود مستضد فوقي 24 و 25 و 26 و 27 و 28. يأخذ هذا الأسلوب الاستفادة من حقيقة أنه بعد T إنتاجية الخلية APC الاتصال، الخلية T تعيد ترتيب الهيكل الخلوي الأكتين لها، استقطاب عليه نحو موقع التماس 21. لا يحدث هذا إعادة ترتيب دون TCR الإشارات، وبالتالي فإنه هو المضاهاة في وقت مبكر من تنشيط خلايا T 19 و 20 و 21. الطريقة المعروضة هنا تتكيف مع هذا النهج لقياس alloreactive تردد T-خلية في بولكلونل السكان T-الخلية. على هذا النحو، فإنه لا يجوز في المستقبل بمثابة أساس لتطوير المقايسات لreactivi المانحة تاي في زرع السريري.

وعلى الرغم من المقارنات المباشرة لم يتم بعد المقدمة، يظهر الكشف عن alloreactive نقاط الاشتباك العصبي المناعة لديها القوة التنبؤية العالية من MLR التقليدية. على سبيل المثال، أظهرت الأعمال السابقة أنه في بروتوكول tolerizing المذكورة أعلاه، تفشل النتائج لMLR لربط موثوق مع نتائج الكسب غير المشروع 2.

وقد تم تطوير عدد من المقايسات للدولة متسامحة عمليا في البشر 9، 10، 11، على الرغم من أن هذه لا قياس وظيفة الخلية المستجيب ردا على مستضد خيفي. في المقابل، IFNγ ELISPOT المقايسات وظيفة 8 قياس المستجيب T-الخلية ولكن لا يمكن التقاط مجموعة كاملة من إفراز السيتوكينات التي قد تكون ذات صلة رفض المزروع الحادة والمزمنة، مثل IL-17 38،> 39. وفحص تخفيف الحد 4، وهي كثيفة العمالة، وعبر فيفو الفحص 6، الأمر الذي يتطلب الفئران، على قيود عملية هامة من شأنها أن تعيق تطبيقها في عملية إعداد سريرية. قد يكون التحسن الذي طرأ مؤخرا على تحليل الخلايا المتكاثرة باستخدام TCR تحليل تسلسل الخلايا T الاستجابة في MLR من قيمة، ولكن مثل فحص المقدمة هنا، سوف تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في الدراسات السريرية 18 و 40.

ومواصلة تطوير المشبك المناعي كشف الفحص يتطلب أن عددا من الأسئلة المهمة يتم الرد عليها. أولا، الفحص كما وضعت يقيس فقط alloreactivity مباشرة. ويشمل المسار المباشر عرض مجمعات MHC / الببتيد خيفي على ناقلات الجنود المدرعة المستمدة من الجهات المانحة. هذا الأخير يتم التخلص من عادة بسرعة بعد الزرع، ومزيد من العرض مستضد خيفي هو carriإد بها ناقلات الجنود المدرعة المتلقي تقديم المانحة سليمة MHC (مسار شبه المباشر) أو معالجتها مستضدات المانحة على الذات MHC (مسار غير مباشر). المسار غير المباشر دافعا هاما للرفض المزروع المزمن 33 و 41.

من حيث المبدأ، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن للكشف عن نقاط الاشتباك العصبي المناعي غير المباشر باستخدام هذا الاختبار، ولكن بشكل غير مباشر alloreactive خلايا T لها تردد أقل بكثير من تلك المباشرة 42 و 43، وهذا يعني أنه ستكون هناك حاجة لتحليل عدد كبير من الأحداث. والاعتبار الثاني هو أن لدينا فقط اختبار هذا الاختبار باستخدام خلايا CD4 + T، في حين أن خلايا CD8 + T هي أيضا عنصرا هاما من الاستجابة لمكافحة المانحة. مرة أخرى، يجب أن يكون من الممكن للكشف عن نقاط الاشتباك العصبي CD8 + T الخلية APC باستخدام هذا الأسلوب. الحد الآخر هو أن أسلوب يتطلب المراجعة اليدوية وتحليل الصور خلية في memb النهائيRANE بوابة الاتصال، ونحن نعمل حاليا على أتمتة هذه الخطوة.

وأخيرا، فإن الأسلوب يتطلب الاختبار والتطوير في المواد البشرية، ويجري حاليا إجراء الدراسات الأولية مع العينات البشرية. سوف مزيد من المظهرية تحليل T-خلية فرعية (أي المستجيب والذاكرة والتنظيمية، وما إلى ذلك) في تركيبة مع الكشف عن نقاط الاشتباك العصبي المناعي في متلقى تمثل نهجا قويا للتميز alloreactive ذخيرة T-الخلية وسيكون محورا مهما لل العمل المستقبلي.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد SCJ من قبل الجمعية الدولية للقلب والرئة زرع زمالة أبحاث والكلية الملكية للأطباء والجراحين في كندا Detweiler السفر Fellowship.SM كان مدعوما جزئيا من قبل الجمعية الدولية للقلب والرئة زرع جائزة التطوير المهني (لSCJ). وأيد SS من قبل المعاهد الوطنية للصحة أوكسفورد للأبحاث الطبية الحيوية البحوث Centre.JH هو المستفيد من الكلى بحوث الزمالة البريطانية العليا غير الطبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المنح التالية لAB وKW: أ الاستئماني لبرنامج منحة ويلكوم (082519Z07Z)، وهي مؤسسة القلب البريطانية برنامج منح (PG / 10 / 62.28504)، وبرنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري 7 (دراسة واحدة، BioDRIM). الكتاب أود أن أشكر مايكل بارسونز ومرفق التدفق الخلوي الأساسية في معهد بحوث Lunenfeld-تانينباوم، نظام الصحة سيناء، تورونتو لتوفير الوصول إلى والدعم مع الصك ImageStream كافة X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Tags

علم المناعة، العدد 122، زرع، المشبك المناعي، والتدفق الخلوي التصوير والتسامح ورفض المزروع، T خلية، خلية مقدمة للمستضد، الخلايا الجذعية
قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juvet, S. C., Moshkelgosha, S.,… More

Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter