ה<em> Ex Vivo</em> קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון
Summary
The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.
Abstract
המעי מציג ארכיטקטורה של מבנים הקריפטה חוזרים המורכבים מסוגים שונים של תאי אפיתל, שכבת רירית מיוחדת המכילה תאים חיסוניים, ו stroma. כל תאים הטרוגניים אלו תורמים הומאוסטזיס מעיים ולהשתתף הגנה מארחת מיקרוביאלית. לכן, זיהוי מודל פונדקאי ללימוד תגובה חיסונית ופעילות מיקרוביאלית של המעי בסביבה במבחנה הוא מאוד מאתגר. במחקרים במבחנה באמצעות שורות תאים אפיתל במעי הנציחו או אפילו הקריפטה עיקרי organoid תרבות אינו מייצגים את הפיסיולוגיה המדויקת של מעי נורמלי microenvironment שלה. כאן, אנו דנים בשיטה של רקמת מעי גסת עכבר culturing בצלחת התרבות וכיצד מערכת ההתרבות לשעבר vivo האיבר הזה יכול להיות מיושמת במחקרים הקשורים תגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית. בניסויי נציג, הראינו כי נקודות בתרבות איבר לבטא פפטידים מיקרוביאלית שו"תonse IL-1β אקסוגניים ו- IL-18. יתר על כן, מולקולות מפעיל מיקרוביאלית המיוצר על ידי רקמות המעי הגס בתרבות איבר ביעילות להרוג coli Escherichia במבחנה. גישה זו, אם כן, יכולה להיות מנוצלת כדי לנתח את התפקיד של דפוסים מולקולריים pathogen- וסכנה הקשורים ואת הקולטנים הסלולרי שלהם בויסות תגובה חיסונית מולדת מעיים ותגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית.
Introduction
המעי מייצג מערכת דינאמית כי משמשת כמחסום עבור מיקרואורגניזמים commensal, נלחם נגד פתוגנים פולשים, ומסדיר את רכב חיידקי 1. תאי אפיתל במעי, מורכב enterocytes, תאי גביע, תאי פנט ותאי enteroendocrine, הוא אוכלוסיות התאים העיקריות המספקות תשובות הגנה מארחות נגד חיידקים במעיים. תאי הגביע לייצר מוקיוס יוצרים מפורזים על גבי שכבת אפיתל 2. התאים ו enterocytes פנט לייצר פפטידים מיקרוביאלית, ציטוקינים, ומיני חמצן וחנקן תגובתי המהווים תגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית לתרום לעיצוב בהרכב המיקרוביאלי במעיים 3, 4. בנוסף לתאי אפיתל, תאי מערכת החיסון כולל מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, תאי הרג טבעיים, לימפוציטים, ואינה תאי הלימפה טה שכבת הרירית המיוחדת ואת submucosa לשחק תפקיד קריטי בתגובות ההגנה המארחת מיקרוביאלית מעיים על ידי ציטוקינים ייצור, כמוקינים, ומתווכים אחרים 5 – 7. כדי להבין איך המערכת החיסונית ברירית מסדיר חיידקים ומספקת הגנה מפני זיהום מיקרוביאלי, חשוב לשקול את יחסי הגומלין המורכבים של אוכלוסיות תאים הטרוגנית של המעי. עם זאת, מודל במבחנה שמקיף את כל התכונות של המעי אינו זמין. לכן, מחקרים מולקולריים על אינטראקצית מארח הפתוגן במעי הם מאוד מאתגרים.
במהלך השנים האחרונות, מערכות מודל מספר המחקים ההיבטים של רירית המעי פותחו על חקירת תהליכים פתופיזיולוגיים המעורבים במחלות מעי דלקתיות (IBD) והפרעות במערכת העיכול אחרים 8 –= "Xref"> 14. הונצחו שורות תאים אפיתל במעי משמשות לעתים קרובות כדי ללמוד מענה ספציפי תא אפיתל. עם זאת, בגלל ביטוי גנים ההפרש ותפקוד בתאים הנציח, את הנתונים המתקבלים באמצעות תאים אלה אינם לעיתים קרובות להתאים עם אלו שנצפו במחקרים in vivo. הקריפטה מעי organoid התרבות התפתח לאחרונה ככלי פוטנציאל להערכת התגובה של האפיתל במעי לגירויים שונים 13. במערכת זו, תאי גזע הקריפטה מותר לגדול ולהתפתח מבנה organoid 3D. בעוד מערכת התרבות organoid מאוד שימושי לחקר היבטים רבים של האפיתל במעי, זה לא לחקות את האינטראקציה המורכבת של תאי מערכת החיסון, תאי אפיתל ומוצרים מיקרוביאלי. תרבות vivo לשעבר של רקמת המעי מציעה ייצוג טוב יותר של תגובות הגנה מארחות in vivo. בשיטה זו, חלק של המעי הוא בתרבית שנינות צלחת תרבית תאיםתקשורת h המתאימה המאפשרת את הסוגים השונים של אוכלוסיות תאים במעי להיות פעילה מבחינה מטבולית עבור h 48 לפחות. לפיכך, תרבות vivo לשעבר של האיבר יכול לשמש כדי למדוד את הביטוי של גנים מיקרוביאלית והתגובות ההגנה המארחת של המעי לגירוי מסוים.
חוקרים כבר משתמשים במערכת תרבות איבר vivo לשעבר ללמוד תגובות הגנה מארחות נגד זיהום מיקרוביאלי במעי 15 – 21. לאחרונה אמצו את מערכת התרבות האיבר כדי ללמוד את התפקיד של inflammasome בתגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית נקודות עכבר 22. Inflammasome היא פלטפורמה מולקולרית עבור הפעלת caspase-1, אשר נדרש לייצור התבגר IL-1β ו- IL-18. הראינו כי IL-1β ו- IL-18 להשרות פפטידים מיקרוביאלית אשר למעשה להרוג pathobionts commensal כגון E. coli </em>. תצפית זו עולה בקנה אחד עם ניטל coli גדילת א ב 22 נקודות עכבר פגום-inflammasome. מערכת זו ולכן ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) ומולקולות חיסון מולדות אחרות בתגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית מעיים וכן בפתוגנזה של הפרעות במערכת עיכול כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן מעי גס (CRC). ישנם יותר מ -200 גני רגישות IBD, ומוטציות רבות מאותם גנים המשויכים רכב חיידקים שינה במעיים. זה הוא בעל משמעות קלינית רבה לקבוע את המנגנון המדויק שדרכו גני IBD-הרגישות להסדיר חיידקים במעיים. המטרה הכללית של שיטה זו היא להציג את פרוטוקול בסיסי בתרבות איבר vivo לשעבר מעי גס להדגים כיצד שיטת התרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית של המעי.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי אפיתל המעי רגישים מאוד מבחינת דרישות הצמיחה שלהם ולכן קשים תרבות. תאי אפיתל מבודדים על ידי טיפול EDTA אינם שורד תרבית תאי תקשורת קונבנציונלית כגון DMEM 8. לכן, מחקרי אינטראקציה לפתוגן מארח באמצעות הקריפטה מבודד או תאי אפיתל עיקריים הם מאוד מאתגרים. לאחרו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, (CCFA; 3711) מניעת סרטן לבין מכון המחקר של טקסס (CPRIT; RP160169), ו UT Southwestern Medical Center שניתנה MHZ
Materials
| Advanced DMEM/ F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride | Sigma | 5634 | |
| FBS, heat inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| Mouse IL-1b recombinan | Reprokine | RKP10749 | |
| Mouse IL-18 recombinant | Reprokine | RKP70380 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Difco Luria-Bertani Broth | BD Bioscience | 244620 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar | Fisher Scientific | DF0075-17-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Uded to measure RNA concentration | |
| UV/Vis Spectrophotometer | BECKMAN | DU 530 | Used to determine E. coli count |
| iScript RT Supermix, 100 rxns | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Univer SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | |
| Lysing Matrix S (1/8"), 2 mL Tube | MP Biomedicals | 116925500 | Used to homgenize colon organ for RNA isolation |
| FastPrep-24 5G System | Bio-Rad | 116005500 | |
| 100×15 Petri Dish | Falcon | 5687 | |
| Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile | Cellstar | 5085 | |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 5698 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sorvall ST40R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| Forma Scientific orbital shaker | Thermo Fisher Scientific |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).
- Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).
- Wu, H. J., Wu, E. The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity. Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).
- Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).
- Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. Innate immunity in disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).
- Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. Intestinal epithelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).
- Autrup, H. Explant culture of human colon. Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).
- Qin, J., et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 464, 59-65 (2010).
- Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut. 61, 961-962 (2012).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. 63, 1345-1354 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61, 1007-1015 (2012).
- Haque, A., et al. Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants. Gut. 53, 1424-1430 (2004).
- Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro. Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).
- Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun. 44, 514-518 (1984).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J Anat. 134, 459-469 (1982).
- Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli. Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).
- Bareiss, P. M., et al. Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa. Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).
- Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants. J Vis Exp. , e4368 (2013).
- Hu, S., et al. The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense. Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).
- Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium. J Pathol. 180, 102-105 (1996).
- Dame, M. K., et al. Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).
- Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni. FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).
