细胞分化是由微环境因素的影响,包括基质组合物和基材的材料性质的宿主调节。我们在这里描述利用细胞微阵列与牵引力显微镜一起同时评估细胞分化和生物力学细胞 – 基底相互作用的微环境上下文的功能的技术。
微制造蜂窝微阵列,其上的弹性的水凝胶表面由生物分子的接触印刷的组合,用于测量排列生化信号对细胞分化的影响提供一个紧密控制的,高通量的设计系统。采用细胞芯片最近作出的努力证明他们的组合研究中,许多微环境因素的并行呈现效用。然而,这些努力主要集中在调查生化线索对细胞反应的作用。在这里,我们提出了一个细胞芯片平台具有可调的材料特性为牵引力显微镜评估由免疫和生物力学的细胞 – 基底相互作用的两个细胞的分化。要做到这一点,我们已开发利用不同的杨氏模量在任显微镜载玻片或玻璃底培养皿中制成的聚丙烯酰胺水凝胶两种不同格式。我们提供BESŧ实践和故障排除的微阵列对这些水凝胶基质制造,芯片上的后续细胞培养和采集数据。该平台非常适合用在生物过程的调查对其中两个生化( 例如 ,细胞外基质组合物)和生物物理( 例如 ,基板的刚度)的线索可能发挥显著,相交的作用。
细胞和周围微环境因素之间的相互作用介导了大量的各种整个发育,稳态和疾病的发病机制1,2,3,4的生物过程。这些微环境相互作用包括通过配体 – 受体结合递送的可溶性因子的细胞,细胞 – 基质结合,和细胞 – 细胞相互作用。除了上述的生化考虑,生物物理参数,如底物的机械性能( 例如 ,杨氏模量,孔隙率)和电池的形状,和相关的下游机械传导日益得到认可作为细胞分化5,6,7,8的关键介质, 9 <sup> 10。从这些微环境相互作用产生的信号作为输入,基因网络和信号通路。此外,这些细胞的固有组分也通过分泌的因子和基质降解酶,完成细胞内在遗传计划和细胞外微环境因素5,11,12之间的复合物共同监管环路反馈提供给微环境。
使用用于微环境因素的控制介绍工程系统的范围内不同的上下文13,14,15的已被证明是有用的。特别是微制造的系统已通过小型化13促进蛋白质和细胞以及高度并行分析的精确的空间图案化<sup类=“外部参照”> 16,17,18,19,20,21,22。细胞微阵列表示一个这样的微加工系统,其中的生物分子的组合是接触印刷到弹性聚丙烯酰胺水凝胶基底23,24,25。细胞粘接性成分(即基质蛋白)的加入使芯片上的持续细胞粘附和文化,这是经常其次是通过免疫组化和荧光记者下游分析。细胞芯片已经富有成效针对实现肝细胞表型的23,26,神经前体分化27 mammar的改进认识ý祖命运决定28,胚胎干细胞的维持/分化23,29,30,肺癌转移31,以及在黑色素瘤32的治疗反应。我们最近证明了使用细胞微阵列的用于限定在定形内胚层规范33,肝脏祖细胞分化34,35,和肺肿瘤细胞对药物的反应36外基质(ECM)蛋白的组合物的作用。在这些作品中,我们把重点放在扩大阵列平台的组合能力和探索细胞内在信号与细胞外基质成分及生物力学的交叉点。此外,我们在这个阵列平台上实现生物物理读数能力提供定量CHARAC细胞收缩的分化terize作用处理35。要做到这一点,我们综合牵引力显微镜(TFM)与细胞芯片,使细胞产生牵引的高通量评估。 TFM是测量细胞产生的牵引力一种广泛使用的方法,并提供了有关单细胞和组织水平的功能与组合物和局部微环境37,38,39,40的生物力学的协调显著见解。因此,TFM与细胞微阵列结合提供了一个高通量系统,用于测量键,生理学相关的生物物理参数。
这里描述的细胞微阵列平台由四部分组成:聚丙烯酰胺基板,阵列,细胞培养和测定的读出的制造,以及数据分析的制造。看到图1为前三个实验部分的示意性概要;参见图2的最后一节的重点放在免疫荧光分析数据的概要总结。为了适应在细胞微阵列平台来生物力学细胞-基底相互作用的研究中,我们使用可调谐的杨氏模量,但相似的孔隙率的聚丙烯酰胺底物,每Wen 等。 41。以使由它们的底物对细胞施加的力的TFM测量,我们实现除了厚的玻璃显微镜载片经常被其它基团使用的玻璃底培养皿的格式。因此,这种细胞芯片平台能够细胞分化通过对显微镜载玻片和细胞产生的力通过免疫荧光TFM单独的玻璃底菜并行测量。我们也应用了一些改进通常与电池芯片使用的分析方法。 SpecificalLY,代替整体岛强度的参数的Z得分,我们测量的单细胞的强度和以占非正常分布和更准确地描述细胞行为申请位数正常化。我们相信,这些改进提供了走向其生物化学和生物物理线索发挥显著,交叉作用的生物学过程的调查特别有用。此外,我们的分析改进使细胞芯片的一系列对这些单细胞和群体水平的行为发散细胞功能研究中的应用。
在我们的实验中,我们已经发现,最常见的故障都涉及到制造的阵列的质量和差的特征在于在感兴趣的生物系统响应。我们建议读者参考表1在细胞微阵列实验常见失效模式和相关的故障排除步骤。特别是关于阵列的质量,我们推荐以下。确认排列程序,参数,以及使用荧光标记的分子,例如若丹明共轭葡聚糖缓冲器的技术质量和鲁棒性。彻底清洁针之前或按照制造商的说明书排列,并进一步在视觉上后检查销渠道使用光学显微镜是明确的碎片。使用通用的蛋白质染色或免疫标记确认阵列生物分子的保留。需要注意的是低于70 kDa的分子量的生物分子经常不保留在水凝胶23, </ SUP> 31。使用多种细胞类型验证阵列的生物分子的细胞的功能。请注意,只有贴壁细胞与阵列兼容;另外,粘附到阵列是依赖于两个小区特定属性( 例如 ,整联表达谱),并将选定ECM蛋白。
由于篇幅有限,我们这里不提供阵列设计,布局和制造广泛的治疗和读者参考以前的作品23,25。我们一般使用10-20独特的生物分子的条件( 即 ,5-10个/条件)组成的100点的子阵列(150微米的光斑直径,450微米的中心-至-中心距离)。子阵列的一个阵列的数量取决于所感兴趣的生物分子的条件的数量,这可以舒适地按比例放大到1,280上的一个25×75毫米的显微镜载玻片(〜6400点的64子阵列)外部参照“> 25,31以上参数将取决于所感兴趣的图案尺寸进一步变化;能够从75产生图案的销- 450微米都是现成的。
阵列实验最好使用其他文化形式的利息高得分排列的情况下,法显装置和生物模型系统验证补充。具体而言,我们建议使用批量培养符合标准的分子生物学技术( 例如 ,定量RT-PCR,免疫印迹)或标准TFM一起进一步验证的选择摆着条件的影响。遗传操作在一个适当的生物模型系统还可以用来确认在阵列观察效果感兴趣的因子( 例如 ,敲除或过表达)。 在体内动物模型表示验证的另一种手段和最近使用的,例如,以确认在半乳凝素-3和半乳凝素8的中心作用肺癌转移的利基,如通过细胞芯片31,49初步确定。
其他一些方法已被用来探测细胞功能的微环境调控,包括各种二维微加工系统18,50,51,52,53,54,55和三维设计的生物材料系统56,57,58 ,59,60,61。与其他方法相比,这里描述的细胞微阵列平台的特别的优点包括:(1)的吞吐量达到数百或数千的因素的不同组合,可实现的相互作用效应的分析; (2)访问,自动成像和分析; (3)与排列因素控制介绍生物化学和生物物理读数的整合; (4),以改变基底材料特性的能力;和(5)含量高的细胞命运和功能的单细胞分析。
综上所述,随着TFM细胞芯片的可调谐基板刚性基材的结合使双方生物化学和生物物理线索的深入刻画。如这里介绍的,该平台是一般化并可以容易地应用于各种贴壁细胞类型和组织的上下文向细胞分化和机械传导的组合微环境调节的改进的理解。
The authors have nothing to disclose.
我们承认奥斯汀Cyphersmith和Mayandi Sivaguru(卡尔R. Woese研究所基因组生物学,伊利诺伊大学厄巴纳 – 香槟分校),与显微镜援助和在显微镜核心慷慨地容纳屏和视频捕捉。
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100× penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22×60 mm coverglasses | Electron Microscope Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25×75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9–1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscope Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2000 ml | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |