Celledifferentiering er reguleret af en række microenvironmental faktorer, herunder både matrix sammensætning og substrat materialeegenskaber. Vi beskriver her en teknik under anvendelse af celle microarrays sammenholdt med trækkraft mikroskopi at evaluere både celledifferentiering og biomekaniske celle-substrat-interaktioner som funktion af microenvironmental kontekst.
Mikrofabrikerede cellulære mikroarrays, der består af kontakt-trykte kombinationer af biomolekyler på en elastisk hydrogel overflade, giver en tæt kontrolleret, high-throughput manipuleret system til måling af virkningen af array biokemiske signaler på celledifferentiering. De seneste bestræbelser bruger celle microarrays har vist deres anvendelighed for kombinatoriske undersøgelser, hvor mange microenvironmental faktorer er vist i parallel. Imidlertid har disse bestræbelser primært fokuseret på at undersøge effekten af biokemiske signaler på celle responser. Her præsenteres en celle microarray platform med afstemmelige materialeegenskaber til evaluering både celledifferentiering ved immunfluorescens og biomekaniske celle-substrat-interaktioner ved trækkraft mikroskopi. For at gøre dette, har vi udviklet to forskellige formater udnytte polyacrylamid hydrogeler af varierende Youngs modul fremstillet på enten objektglas eller glas-bottom petriskåle. Vi leverer best praksis og fejlmelding af fremstilling af mikroarrays på disse hydrogel substrater, den efterfølgende cellekultur på mikroarrays, og erhvervelse af data. Denne platform er velegnet til anvendelse i undersøgelser af biologiske processer, for hvilke både biokemiske (f.eks, ekstracellulær matrix sammensætning) og biofysisk (fx substrat stivhed) signaler kan spille betydelige, krydsende roller.
Interaktioner mellem celler og omgivende microenvironmental faktorer medierer en lang række biologiske processer i hele udvikling, homeostase, og sygdom patogenese 1, 2, 3, 4. Disse microenvironmental interaktioner omfatter levering af opløselige faktorer til celler, celle-matrix binding, og celle-celle-interaktioner via ligand-receptor-binding. Ud over de ovennævnte biokemiske betragtninger biofysiske parametre, såsom substrat mekaniske egenskaber (f.eks, Youngs modul, porøsitet) og celleform, og tilhørende nedstrøms mechanotransduction har i stigende grad vundet anerkendelse som vigtige mediatorer af celledifferentiering 5, 6, 7, 8, 9 <sup> 10. Signaler som følge af disse microenvironmental interaktioner tjener som input til gen-netværk og signalveje. Desuden er disse celle-iboende komponenter giver også feedback til mikromiljø via udskilles faktorer og matrix-nedbrydende enzymer, der fuldfører en kompleks samregulering loop mellem celle-iboende genetiske programmer og celle-ydre microenvironmental faktorer 5, 11, 12.
Anvendelsen af konstruerede systemer til kontrolleret præsentation af microenvironmental faktorer har vist sig nyttige i en række forskellige sammenhænge 13, 14, 15. Mikrofabrikerede systemer i særdeleshed har lettet præcis rumlig mønsterdannelse af proteiner og celler samt parallelt i stor analyse via miniaturisering 13, <supclass = "xref"> 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cell microarrays repræsenterer et sådant mikrofabrikerede system, hvor kombinationer af biomolekyler er kontakt-trykt på en elastisk polyacrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Medtagelsen af celle-klæbende komponenter (dvs. matrixproteiner) aktiverer vedvarende celleadhæsion og kultur på mikroarrays, der ofte efterfulgt af nedstrøms analyse via immunocytokemi og fluorescerende reportere. Cell microarrays er produktivt rettet mod at opnå en forbedret forståelse af lever-fænotype 23, 26, neural forløber differentiering 27, Mammary stamfader skæbne beslutninger 28, embryonale stamceller vedligeholdelse / differentiering 23, 29, 30, lungekræft metastase 31, og terapeutisk respons i melanom 32. Vi har for nylig demonstreret brugen af celle- microarrays for at definere rollen af ekstracellulær matrix (ECM) protein sammensætning i endoderm specifikation 33, liver progenitor differentiering 34, 35 og lunge tumor celle lægemiddelrespons 36. I disse værker, har vi fokuseret på at udvide de kombinatoriske evner array-platformen og udforske krydsene med celle-iboende signalering med ekstracellulær matrix sammensætning og biomekanik. Derudover har vi implementeret biofysiske udlæsninger i dette array platform for at tilvejebringe evnen til kvantitativt karakrisere rolle celle kontraktilitet i differentiering processer 35. For at gøre dette, vi integreret trækkraft mikroskopi (TFM) med celle microarrays at aktivere high-throughput vurdering af celle-genereret trækkraft. TFM er en bredt anvendt fremgangsmåde til måling af celle-genereret trækkræfter og har givet betydelige indsigter om koordinering af enkelt-celler og væv-niveau funktion med sammensætningen og biomekanik det lokale mikromiljø 37, 38, 39, 40. Således kombinerer TFM med celle mikroarrays tilvejebringer en høj kapacitet til måling Key, fysiologisk relevante biofysiske parametre.
Cellen microarray platform beskrevet her består af fire sektioner: fremstilling af polyacrylamid substrater, fabrikation af arrays, cellekultur og assay udlæsning og analyse af data. SeFigur 1 for en skematisk oversigt over de første tre eksperimentelle sektioner; se figur 2 for en skematisk oversigt over det sidste afsnit med fokus på analyse af immunofluorescens data. For at tilpasse cellen microarray platform til studier af biomekaniske celle-substrat-interaktioner, vi anvendte polyacrylamid substrater af afstemmelige Youngs modul men lignende porøsitet, pr Wen et al. 41. For at aktivere TFM målinger af kræfter, der udøves af celler på deres substrat, vi gennemført en glasbund petriskål format udover den tykke mikroskopglasplader ofte anvendes af andre grupper. Således er denne celle microarray platform er i stand til parallelle målinger af celledifferentiering via immunofluorescens på mikroskopobjektglas og celle-genererede kræfter via TFM på separate glas-bottom retter. Vi har også anvendt flere forbedringer i den analytiske tilgang almindeligt anvendt med celle mikroarrays. bestemt foreskriverly, i stedet for parametrisk Z-scoren for den samlede ø intensitet måler vi encellede intensitet og anvende fraktil normalisering for at tage højde for ikke-normale fordelinger og mere præcist beskriver cellulær adfærd. Vi mener, at disse forbedringer giver særlig anvendelighed over for undersøgelser af biologiske processer, hvor både biokemiske og biofysiske tidskoder spiller væsentlige, krydsende roller. Endvidere vores analytiske forbedringer gør det muligt at anvende celle microarrays til undersøgelser af en række cellulære funktioner, for hvilke encellede og population-niveau adfærd afviger.
I vores eksperimenter har vi fundet, at de mest almindelige fejl er relateret til kvaliteten af jern- arrays og dårligt karakteriseret respons i det biologiske system af interesse. Vi henviser læseren til tabel 1 for fælles svigt celle microarray eksperimenter og tilhørende fejlfindingstrin. Vedrørende kvaliteten af arrays i særdeleshed, anbefaler vi følgende. Bekræft teknisk kvalitet og soliditet gruppere programmer, parametre og buffere hjælp fluorescensmærkede molekyler såsom rhodamin-konjugeret dextran. Grundigt rene stifter enten før eller efter at gruppere pr producentens anvisninger og yderligere visuelt kontrollere, at pin-kanaler er fri for snavs ved hjælp af et lysmikroskop. Bekræft array biomolekyle fastholdelse ved hjælp af generelle protein pletter eller immunolabeling. Bemærk, at biomolekyler med en molekylvægt under 70 kDa ofte ikke tilbageholdes i hydrogelen 23, </ sup> 31. Validere array biomolekyle celle-funktionalitet ved hjælp af flere celletyper. Bemærk, at kun adhærente celler er forenelige med arrays; derudover, adhæsion til arrays er afhængig både celle-specifikke egenskaber (fx integrin ekspression profil) og de udvalgte ECM-proteiner.
På grund af begrænset plads, har vi ikke givet en omfattende behandling af array design, layout og fabrikation her og henvise læseren til forrige værker 23, 25. Vi bruger generelt 100 spot subarrays (150 um spot diameter, 450 um center-til-center afstand) sammensat af 10-20 unikke biomolekylære betingelser (dvs. 5-10 pletter / tilstand). Antallet af subarrays i ét array varierer afhængigt af antallet af biomolekylære betingelser af interesse, som kan være komfortabelt opskaleres til 1.280 på en 25 x 75 mm mikroskopobjektglas (~ 6.400 pletter i 64 subarrays)xref "> 25, 31 Parametrene ovenfor vil yderligere variere afhængigt af mønstret størrelse af interesse;. pins stand til at generere mønstre på 75 – 450 um er let tilgængelige.
Array eksperimenter er bedst suppleret med validering af høj scoring opstillede betingelser af interesse ved hjælp af andre kultur-formater, assay udlæsninger og biologiske modelsystemer. Konkret anbefaler vi yderligere validering effekter af udvalgte opstillede betingelser ved hjælp bulk-kulturer i forbindelse med standard molekylærbiologiske teknikker (f.eks QRT-PCR, immunoblotting) eller standard TFM. Genetisk manipulation (f.eks knockdown eller overekspression) af faktoren af interesse i et givet biologisk modelsystem kan også bekræfte, effekter observeret i arrays. In vivo dyremodeller repræsenterer et andet middel til validering og blev for nylig brugt, for eksempel til at bekræfte den centrale rolle, galectin-3 og galectin-8 ilungekræft metastatisk niche, som oprindeligt identificeret via celle microarray 31, 49.
En række andre fremgangsmåder er blevet anvendt til at probe microenvironmental regulering af cellulære funktioner, herunder en række to-dimensionale mikrofabrikerede systemer 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 og de tredimensionelle manipulerede biomateriale systemer 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I sammenligning med andre metoder, de særlige fordele ved den celle microarray platform beskrevet her består af: (1) kapacitet Op tilhundredvis eller tusindvis af forskellige kombinationer af faktorer, der gør det muligt analyse af interaktion effekter; (2) tilgængelige, automatiseret billedbehandling og analyse; (3) integration af både biokemiske og biofysiske udlæsninger med kontrolleret præsentation af grupperede faktorer; (4) evne til at variere substrat materialeegenskaber; og (5) med højt indhold encellede analyse af celle skæbne og funktion.
Sammenfattende kombinationen af celle- microarrays med TFM på substrater af afstemmelig substrat stivhed muliggør grundig karakterisering af både biokemiske og biofysiske signaler. Som præsenteres her, denne platform er generaliseres og kan let anvendes til en række af adhærente celletyper og væv sammenhænge i retning af en bedre forståelse af kombinatorisk microenvironmental regulering af celledifferentiering og mechanotransduction.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Austin Cyphersmith og Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institut for Genomic Biologi, University of Illinois i Urbana-Champaign) for at få hjælp med mikroskopi og for generøst imødekommende skærm og videooptagelse på mikroskopi kerne.
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100× penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22×60 mm coverglasses | Electron Microscope Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25×75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9–1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscope Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2000 ml | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |