Celledifferensiering er regulert av en rekke microenvironmental faktorer, blant annet matrise sammensetning og underlaget materialegenskaper begge. Vi beskriver her en teknikk for anvendelse av mikromatriser celle i forbindelse med trekkraft mikroskopi for å evaluere både celledifferensiering og biomekaniske celle-substrat interaksjoner som en funksjon av microenvironmental sammenheng.
Microfabricated cellulære mikromatriser, som består av kontakttrykte kombinasjoner av biomolekyler på en elastisk hydrogel overflate, gir en kontrollert, high-throughput konstruert system for å måle effekten av kledd biokjemiske signaler på celledifferensiering. Siste innsats med bruk av celle mikromatriser har vist sin nytte for kombinatoriske studier hvor mange microenvironmental faktorer presenteres i parallell. Imidlertid har dette arbeidet fokusert primært på å undersøke effekten av biokjemiske signaler på celle responser. Her presenterer vi en celle microarray plattform med tunbare materialegenskaper for å vurdere både celledifferensiering av immunfluorescens og biomekanisk celle-substrat interaksjoner med trekkraft mikroskopi. For å gjøre dette, har vi utviklet to forskjellige formater utnytte polyakrylamidprodukter hydrogeler av varierende Youngs modulus fabrikkert på enten objektglass eller glassbunn petriskåler. Vi tilbyr best praksis og feilsøking for fabrikasjon av mikromatriser på følgende hydrogel underlag, den påfølgende cellekultur på mikromatriser, og oppkjøpet av data. Denne plattformen er godt egnet for anvendelse ved undersøkelser av biologiske prosesser hvor det både biokjemiske (f.eks, ekstracellulær matrise-blandingen) og biofysiske (f.eks substrat stivhet) signaler kan spille betydelige, kryssende roller.
Interaksjoner mellom celler og omkringliggende microenvironmental faktorer formidle et stort utvalg av biologiske prosesser gjennom utvikling, homeostase og sykdommer patogenese en, to, tre, fire. Disse microenvironmental interaksjoner omfatter levering av løselige faktorer til celler, celle-matrise binding, og celle-celle interaksjoner via ligand-reseptor binding. I tillegg til de ovennevnte biokjemiske betraktninger, biofysiske parametre, såsom substratet mekaniske egenskaper (f.eks, Youngs modulus, porøsitet) og celleform, og tilhørende nedstrøms mechanotransduction har i økende grad fått anerkjennelse som viktige mediatorer for celledifferensiering 5, 6, 7, 8, 9 <sup>, 10. Signaler som følge av disse microenvironmental interaksjoner tjene som input til genet nettverk og signalveier. Videre disse celle indre komponenter også gi tilbakemelding til mikromiljøet via skilles faktorer og matrisenedbrytende enzymer, som fullfører en kompleks co-reguleringssløyfe mellom celle iboende genetiske programmer og celle ytre microenvironmental faktorer 5, 11, 12.
Bruken av konstruerte systemer for kontrollert fremstilling av microenvironmental faktorer har vist seg nyttig i en rekke forskjellige sammenhenger 13, 14, 15. Microfabricated systemer i særdeleshet har tilrettelagt presis romlige fordelingen av proteiner og celler samt svært parallelized analyse via miniatyrisering 13, <supclass = "xref"> 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Celle mikromatriser representere en slik microfabricated system i hvilke kombinasjoner av biomolekyler er kontakt-trykket på en elastisk polyakrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Inkluderingen av celleheftende komponenter (nemlig matriksproteiner) muliggjør vedvarende celleadhesjon og kultur på mikromatriser, som ofte følges av nedstrøms analyse via immunocytokjemi og fluorescerende pressen. Celle mikromatriser er produktivt rettet mot å oppnå en bedre forståelse av leveren celle fenotype 23, 26, nevrale forløper differensiering 27, Mammary stamfar skjebne beslutninger 28, embryonal stamcelle vedlikehold / differensiering 23, 29, 30, kreft metastase 31 lunge, og terapeutisk respons i melanom 32. Vi har nylig vist at bruken av celle mikromatriser for å definere rollen av ekstracellulær matriks (ECM) proteinsammensetningen i endoderm spesifikasjon 33, leverstamcelledifferensiering 34, 35, og lungetumorcellelegemiddelrespons 36. I disse arbeidene, har vi fokusert på å utvide kombinatoriske egenskapene til array plattform og utforske skjæringspunktene celle-egenverdi signale med ekstracellulære matrise sammensetning og biomekanikk. I tillegg har vi implementert biofysiske avlesninger i denne array plattform for å gi muligheten til å kvantitativt kjenneterize rolle celle kontraktilitet i differensieringsprosesser 35. For å gjøre dette, integrert vi trekkraft mikroskopi (TFM) med celle mikromatriser for å muliggjøre høy gjennomstrømming vurdering av celle-generert trekkraft. TFM er en mye brukt metode for å måle cellegenerert trekkrefter og har gitt betydelige innsikt om samordning av enkelt-celle og vev-nivå funksjon med den sammensetning og biomekaniske i den lokale mikro 37, 38, 39, 40. Dermed kombinerer TFM med celle mikromatriser gir en høy gjennomstrømming system for måling av nøkkel, fysiologisk relevante biofysiske parametere.
Cellen microarray plattformen er beskrevet her består av fire deler: fabrikasjon av polyakrylamid substrater, fabrikasjon av matriser, cellekulturen og analysen avlesning, og analyse av data. SeFigur 1 på en skjematisk oppsummering av de første tre forsøks seksjoner; se figur 2 for en skjematisk oversikt over den siste delen med fokus på analyse av immunfluorescens data. For å tilpasse den celle microarray plattformen til studier av biomekaniske celle-substrat interaksjoner, brukte vi polyakrylamid-substrater av avstembar Youngs modul, men lignende porøsitet, per Wen et al. 41. For å aktivere TFM måling av krefter som utøves av celler som på deres substrat, gjennomførte vi en glassbunn petriskål format i tillegg til den tykke glassobjektglassene hyppig benyttet av andre grupper. Således er i stand til å parallelle målinger av celledifferensiering via immunfluorescens på objektglass og celle-genererte krefter via TFM på separate glassbunn retter denne cellen microarray plattformen. Vi har også søkt flere forbedringer til den analytiske tilnærmingen er vanlig på celle mikromatriser. specifically, i stedet for parametrisk Z-scoring av generelle øya intensitet, måler vi encellede intensitet og gjelder quantile normalisering for å ta høyde for ikke-normalfordelinger og mer nøyaktig beskrive cellular atferd. Vi mener at disse forbedringene gir særlig nytte mot undersøkelser av biologiske prosesser der både biokjemiske og biofysiske signaler spille viktige, kryssende roller. Videre våre analytiske forbedringer muliggjøre anvendelsen av celle mikromatriser til studier av en rekke cellefunksjoner som enkelt-celle og populasjonsnivå oppførsel divergerer.
I våre forsøk har vi funnet at de mest vanlige feil er knyttet til kvaliteten av fabrikkerte matriser og dårlig karakterisert reaksjon i det biologiske system av interesse. Vi henviser leseren til tabell 1 for vanlige feilmodi i celle microarray eksperimenter og tilhørende feilsøkingen. Når det gjelder kvaliteten på arrays i særdeleshet, anbefaler vi følgende. Bekreft den tekniske kvaliteten og robustheten arraying programmer, parametere og buffere bruker fluorescensmerkede molekyler som rhodaminkonjugert dekstran. Rengjør pins enten før eller etter arraying per produsentens instruksjoner og videre visuelt sjekke at PIN-kanaler er fri for rusk å bruke et lysmikroskop. Bekreft Arrayed biomolecule oppbevaring bruke generelle protein flekker eller immunolabeling. Legg merke til at biomolekyler med en molekylvekt under 70 kDa blir ofte ikke holdes tilbake i hydrogelen 23, </ sup> 31. Validere Arrayed biomolecule celle-funksjonalitet ved hjelp av flere celletyper. Merk at bare adherente celler er kompatible med matriser; i tillegg, er adhesjon til matriser avhengig av både celle-spesifikke egenskaper (for eksempel integrin uttrykk profil), og de valgte ECM-proteiner.
På grunn av begrenset plass, har vi ikke gitt en omfattende behandling av matrise design, layout og fabrikasjon her og henviser leseren til forrige fungerer 23, 25. Vi bruker vanligvis 100 stikk undergrupper (150 mikrometer sted diameter, 450 mikrometer senter-til-senter avstand) består av 10-20 unike biomolekyl forhold (dvs. 5-10 flekker / tilstand). Antallet underordnede rekker i en matrise varierer avhengig av antall biomolekyl tilstander av interesse, som kan være komfortabelt skaleres opp til 1280 på en 25 x 75 mm objektglass (~ 6.400 flekker i 64 undergrupper)xref "> 25, 31 Parametrene ovenfor vil ytterligere variere avhengig av mønsterstørrelsen er av interesse;. nålene som er i stand til å generere mønstre 75-450 um er lett tilgjengelige.
Array eksperimenter er best supplert med validering av høy-scoring kledd forhold av interesse ved hjelp av andre kultur formater, analyseavlesninger, og biologiske modellsystemer. Spesielt anbefaler vi ytterligere validering av effekter av utvalgte kledd forholdene ved hjelp av bulk kulturer i forbindelse med standard molekylærbiologiske teknikker (f.eks QRT-PCR, immunoblotting) eller standard TFM. Genetisk manipulasjon (f.eks knockdown eller overekspresjon) av faktor av interesse i et egnet biologisk modellsystem kan også tjene til å bekrefte effektene som observeres i matriser. In vivo dyremodeller representerer en annen metode for validering og ble nylig anvendt, for eksempel, for å bekrefte den sentrale rollen til galectin-3 og galectin-8 ilungekreft metastatisk nisje, som i utgangspunktet identifisert via celle microarray 31, 49.
En rekke andre fremgangsmåter har vært anvendt for å probe microenvironmental regulering av cellefunksjoner, inkludert en rekke to-dimensjonale microfabricated-systemer 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 og tredimensjonale konstruerte biomateriale systemer 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I sammenligning med andre metoder, de spesielle fordeler ved cellen microarray plattformen som er beskrevet her består av: (1) gjennomstrømning inntilhundrevis eller tusenvis av forskjellige kombinasjoner av faktorer, slik at analyse av interaksjonseffekter; (2) tilgjengelig, automatisert bildebehandling og analyse; (3) integrering av både biokjemiske og biofysiske avlesninger med kontrollert presentasjon av oppstilt faktorer; (4) evnen til å variere underlaget materialegenskaper; og (5) høyt innhold av single-celle analyse av celle skjebne og funksjon.
I sammendraget, en kombinasjon av celle mikromatriser med TFM på underlag av fleksibel substrat stivhet gjør grundig karakterisering av både biokjemiske og biofysiske signaler. Som presenteres her, er denne plattformen generaliseres og kan lett anvendes på en rekke adherente celletyper og vev-kontekster i retning av en forbedret forståelse av kombinatorisk microenvironmental regulering av celledifferensiering og mechanotransduction.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Austin Cyphersmith og Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institutt for Genomisk Biology, University of Illinois i Urbana-Champaign) for å få hjelp med mikroskopi og for sjenerøst imøtekommende skjerm og videoopptak på mikros kjernen.
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100× penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22×60 mm coverglasses | Electron Microscope Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25×75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9–1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscope Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2000 ml | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |