Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.
elastik hidrojel yüzeyinde biyomoleküllerin temas baskılı kombinasyonları oluşur microfabricated hücresel mikroarray'ler, hücre farklılaşması üzerine dizilmiş biyokimyasal sinyallerin etkisini ölçmek için bir sıkı kontrol, yüksek verimli mühendislik sistem sağlamak. Hücre mikrodiziler kullanarak Son çalışmalar, birçok microenvironmental faktör paralel olarak sunulduğu kombinasyon çalışmaları için kendi programını ortaya koymuştur. Ancak bu çabalar hücre yanıtları biyokimyasal ipuçlarının etkilerini araştıran öncelikle odaklanmıştır. Burada, çekiş kuvveti mikroskobu ile immünofloresan ve biyomekanik hücre-substrat etkileşimleri hem hücre farklılaşması değerlendirmek için ayarlanabilir malzeme özelliklerine sahip bir cep mikroarray platformu sunuyoruz. Bunu yapmak için, biz ya mikroskop lamı veya cam alt Petri kapları üzerinde fabrikasyon Young modülü değişen poliakrilamid hidrojeller kullanan iki farklı biçimleri geliştirmişlerdir. Biz bes sağlamakBu hidrojel yüzeylerde microarrays imalat, mikrodizinlerinde sonraki hücre kültürü ve veri edinimi için t uygulamaları ve sorun giderme. Bu platform da biyokimyasal (örneğin, hücre dışı matris bileşimi) hem ve biyofiziksel (örneğin, alt-tabaka sertliği) işaretler rolleri kesişen önemli oynayabilir biyolojik proseslerin incelenmesi kullanılmak için çok uygundur.
Hücre ve çevresindeki mikro-çevresel faktörler arasındaki etkileşimler geliştirme, homeostaz ve hastalığın patojenezi, 1, 2, 3, 4 boyunca biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik aracılık eder. Bu mikro-çevresel etkileşimler ligand-reseptörü aracılığıyla hücrelere çözünür faktörlerin teslim bağlayıcı hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri bulunmaktadır. Yukarıda biyokimyasal açıdan ek olarak, bu tür alt-tabaka mekanik özellikleri biofiziksel parametreleri (örneğin, Young modülü, gözeneklilik) ve hücre şekli ve ilişkili alt mechanotransduction artan hücre farklılaşması 5, 6, 7, 8, anahtar aracılar olarak tanındı adres 9 <sup> 10. Bu microenvironmental etkileşimler kaynaklanan sinyaller gen ağları ve sinyal yolları girdi olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, bu hücre iç bileşenler aynı zamanda hücre hakiki genetik programlar ve hücre dış mikro-çevresel faktörlerin 5, 11, 12 arasındaki karmaşık eş düzenleyici döngü tamamlayan salgılanan faktörler ve matris-parçalayıcı enzimler yoluyla mikro geri bildirimde bulunur.
Mikro-çevresel faktörler tarafından kontrol edilen sunum için tasarlanmış sistemlerinin kullanımı farklı bağlamlarda 13, 14, 15, bir dizi yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle mikrofabrike sistemleri, minyatürleştirme 13 ile protein ve hücreleri hem de yüksek paralelleştirilmiş analiz hassas mekansal model oluşturmanın kolaylaştırmıştır <supSınıf = "xref"> 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Hücre mikrodizileri biyomoleküllerin kombinasyonları iletişim baskılı bir esnek poliakrilamid hidrojel alt-tabaka 23, 24, 25 üzerine olan bu tür bir mikrofabrike sistemi temsil eder. Hücre-yapışkan bileşenlerin (yani matriks proteinleri) dahil sık sık immünsitokimya ve floresan gazetecilere yoluyla aşağı analizi ile takip edilmektedir mikrodizinlerinde sürekli hücre yapışması ve kültürünü mümkün kılar. Hücre mikroarray'ler verimli karaciğer hücre fenotip 23, 26, nöral prekürsör farklılaşma 27 mammar geliştirilmiş bir anlayış elde yönelik edilmiştiry progenitör kader kararları 28, embriyonik kök hücre bakım / farklılaşma 23, 29, 30, akciğer kanseri metastazı 31 ve melanom 32 tedavi yanıtı. Son zamanlarda endoderm tarifnamede 33, karaciğer progenitör farklılaşma 34, 35, ve akciğer tümör hücre tedaviye yanıt 36 hücre dışı matris (ECM) protein bileşiminin rolünü tanımlamak için hücre mikrodizileri kullanımını göstermiştir. Bu çalışmalarda, biz dizi platformunun kombinasyon yeteneklerinin artırılması ve hücre dışı matriks kompozisyonu ve biyomekanik ile hücre içsel sinyalizasyon kavşakları keşfetmeye odaklanmıştır. Ayrıca, yetenek kantitatif şekilde karakterize sağlamak için bu dizi platformda biyofizik readouts hayata geçirdikfarklılaşma hücre kontraktilite terize rolü 35 işler. Bunu yapmak için, biz hücre tarafından üretilen çekiş yüksek verimlilik değerlendirilmesini sağlamak için hücre mikroarray'ler ile çekme kuvvet mikroskobu (TFM) entegre edilmiştir. TFM hücresi tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, bileşim ve yerel mikro-37, 38, 39, 40 biyomekanik tek-hücre ve doku düzeyinde işlev koordinasyonu ile ilgili önemli bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, hücre mikrodizileri ile TFM birleştiren temel fizyolojik olarak uygun biofiziksel parametreleri ölçmek için yüksek verimli bir sistem sağlar.
Burada anlatılan hücre mikroarray platformu dört bölümden oluşmaktadır: poliakrilamid yüzeylerde, diziler, hücre kültürü ve tahlil okuma üretiminde ve verilerin analizi imalatı. Görmekİlk üç deney bölümleri şematik özeti Şekil 1 'dir; immünofloresan verilerin analizi odaklanarak son bölümde bir şematik özeti için bakınız Şekil 2. Biyomekanik hücre alt-tabaka etkileşim çalışmalar hücre mikrodizi platformu adapte amacıyla, Wen et al başına ayarlanabilir Young modülü ama benzer gözenekli poliakrilamid substratlar kullanılır. 41. onların alt tabaka üzerinde hücreler tarafından uygulanan kuvvetlerin TFM ölçümleri etkinleştirmek için, biz sık sık diğer gruplar tarafından kullanılan slaytlar kalın cam mikroskop ek olarak cam alt Petri kabı biçimi uyguladı. Bu nedenle, bu hücre mikrodizi platformu ayrı cam alt yemekler TFM ile mikroskop lamı ve hücre tarafından üretilen kuvvetlerin immünofloresan ile hücre farklılaşmasının paralel ölçümler yeteneğine sahiptir. Biz de yaygın hücre mikroarray'ler ile kullanılan analitik yaklaşıma çeşitli iyileştirmeler uyguladık. Özelly, yerine genel ada yoğunluğu parametrik Z-puanlama, biz tek hücreli yoğunluğunu ölçmek ve normal olmayan dağılımlar için hesap ve daha doğru hücresel davranışını tanımlamak için kantil normalleşme uygulayın. Biz bu gelişmeler biyokimyasal ve biyofiziksel hem ipuçları önemli, kesişen rol oynadığı biyolojik süreçlerin araştırılması yönünde özellikle yarar sağladığına inanıyoruz. Ayrıca, bizim analitik gelişmeler tek hücreli ve nüfus seviyesi davranışı sapmak hangi hücresel fonksiyonları bir dizi çalışmalara hücre mikroarray'ler uygulanmasını sağlar.
Deneylerde, biz en yaygın hataları uydurma dizilerin kalitesi ile ilgili ve kötü ilgi biyolojik sistem yanıtı karakterize bulduk. Biz cep mikroarray deneylerde yaygın arıza modları ve ilişkili sorun giderme adımları için Tablo 1'de okuyucu bakın. Özellikle dizilerin kalitesiyle ilgili, biz aşağıdaki öneriyoruz. Böyle rodamin-konjuge dekstran gibi floresan etiketli molekülleri kullanarak programları parametreler ve tamponlar arraying teknik kalite ve sağlamlığı onaylayın. önce ya da daha fazla görsel üreticinin talimatlarına göre arraying ve sonra ya tamamen temiz pimleri pim kanalları ışık mikroskobu kullanılarak enkaz açık olup olmadığını kontrol edin. genel protein lekeleri veya immün kullanarak dizilmiş biyomolekül tutma onaylayın. 70 kDa altında bir moleküler ağırlığa sahip biyomoleküller sık hidrojel 23 korunmaz unutmayın </ sup> 31. Birden fazla hücre tiplerini kullanarak dizilmiş biyomolekül hücre işlevselliğini doğrulamak. Sadece yapışık hücreler diziler ile uyumlu olduğunu unutmayın; Buna ek olarak, diziler kaynaşmasının hücreye özel özellikleri (örneğin, integrin ifade profili) ve seçilen ECM proteinleri bağlıdır.
Sınırlı yer nedeniyle, burada dizi tasarım, düzen ve imalat geniş bir tedavi verilmez ve daha önceki 23 çalışır için, 25 okuyucu bakın. Biz genel olarak 10-20 benzersiz biyomolekül koşulları (yani, 5-10 noktalar / durumu) oluşan 100 nokta Altdizilim (150 mikron nokta çapı 450 mikron merkez-merkez mesafesi) kullanın. bir dizide altdizilimlerden sayısı rahatça biri 25 × 75 mm mikroskop lamı üzerine 1,280 kadar ölçeklendirilebilir ilgi biyomolekül koşulları sayısına bağlı olarak değişir (~ 64 altdizilimlerden içinde 6.400 noktalar)xref "> 25, 31 parametre üzerinde daha fazla ilgi desen boyutuna bağlı olarak değişir;. 75 desen üretme kapasitesine sahip pimleri – 450 mikron kolayca kullanılabilir.
Dizi deneyler en iyi diğer kültür biçimlerini kullanarak yüksek faiz-puanlama dizilmiş koşulları, tahlil okumalara ve biyolojik model sistemleri doğrulama ile tamamlanmaktadır. Spesifik olarak, daha ayrıntılı bir şekilde, standart moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, QRT-PCR, immün) veya standart TFM ile bağlantılı dökme kültürleri kullanılarak seçme dizilmiş koşullarının kanıtlayan önerilir. Genetik manipülasyon Ayrıca diziler gözlenen etkileri onaylamak için hizmet, uygun bir biyolojik model sisteminde ilgi faktörünün (örneğin, demonte veya aşırı ifadesi). In vivo hayvan modelleri doğrulama başka bir yöntem temsil en son galektin-3 ve galektin-8 merkezi rolü teyit etmek için, örneğin, kullanılanAkciğer kanseri metastatik niş, başlangıçta hücre mikroarray 31 49 aracılığıyla belirledi.
Diğer bir dizi yöntem, iki boyutlu bir mikrofabrike sistemleri 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ve üç boyutlu tasarlanmış biyomalzeme sistemleri 56, çeşitli 57, 58 dahil olmak üzere, hücresel fonksiyonları microenvironmental düzenleme, problamak için kullanılmıştır , 59, 60, 61. diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada tarif edilen hücre mikrodizi platformun özel avantajlar oluşur: (1) ila yukarı çıktıyüzlerce veya etkileşim etkilerinin analizi sağlayan faktörlerin farklı kombinasyonları, binlerce; (2) erişilebilir, otomatik görüntüleme ve analizi; (3) dizilmiş faktörlerin kontrollü sunumu ile hem biyokimyasal ve biyofiziksel okumalarla entegrasyonu; (4) alt-tabaka malzemesi özellikleri değiştirme yeteneğini de; hücre kaderinin ve fonksiyonu ve (5) yüksek içeriği tek hücre analizi.
Özetle, ayarlanabilir alt tabaka sertliği yüzeylerde TFM hücre microarrays kombinasyonu hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Burada görüldüğü gibi, bu platform genellenebilir ve hali hazırda hücre farklılaşması ve mechanotransduction kombinatoryal mikro-çevresel bir düzenleme daha iyi anlaşılması doğru yapışık hücre tipleri ve doku çeşitli bağlamlarda da uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz kabul Austin Cyphersmith ve Mayandi Sivaguru (Genomik Biyoloji Carl R. Woese Enstitüsü, University of Illinois at Urbana Champaign) mikroskobu ile yardım için ve cömertçe mikroskopi özünde ekran ve video çekimi barındırmak için.
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100× penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22×60 mm coverglasses | Electron Microscope Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25×75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9–1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscope Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2000 ml | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |