يسمح (رنا catesbeiana) كييس الضفدع الأمريكي الفحص المباشر من علم وظائف الأعضاء خلايا الشعر. هنا يتم وصف تشريح وإعداد كييس الضفدع للدراسات الفيزيائية الحيوية. وتبين لنا تجارب تمثيلية من هذه الخلايا الشعر، بما في ذلك حساب علاقة قوة النزوح حزمة وقياس حركته السهلة.
دراسة السمع والتوازن تقع على الأفكار المستقاة من الدراسات الفيزيائية الحيوية أنظمة نموذجية. واحدة من هذه النموذج، وكييس من الضفدع الأمريكي، أصبحت الدعامة الأساسية للبحث السمعي والدهليزي. وقد كشفت الدراسات التي أجريت على هذا الجهاز كيف الشعر الخلايا الحسية يمكن الكشف بنشاط إشارات من البيئة. لأن هذه الدراسات، ونحن الآن فهم أفضل للالنابضة الميكانيكية وتوطين قنوات التنبيغ خلية الشعر، دور الكالسيوم في التكيف الميكانيكية، وهوية التيارات خلية الشعر. استمر هذا الجهاز للوصول للغاية لتوفير نظرة ثاقبة على عمل خلايا الشعر. نحن هنا وصف إعداد كييس الضفدع للدراسات الفيزيائية الحيوية في خلايا الشعر لها. نحن تشمل إجراء تشريح كامل وتوفير بروتوكولات محددة لإعداد كييس في سياقات محددة. ندرج بالإضافة إلى النتائج ممثل باستخدام هذا الإعداد، بما في ذلك حسابربطة الشعر لحظية علاقة القوة التشريد وقياس التذبذب عفوية حزمة و.
أجهزة acousticolateralis من الثدييات تمتلك بنية معقدة وتقع ضمن مكانة التشريحية التي يمكن أن يكون من الصعب الوصول إليها. على سبيل المثال، تتكون القوقعة الثدييات متاهة المتصاعد، وجزءا لا يتجزأ من داخل العظم الصدغي سميكة. عزل القوقعة غالبا ما يسبب التلف الميكانيكي إلى الخلايا الحسية الكذب داخلها، وبالتالي قد ثبت أن يكون مهمة صعبة 1. وهكذا تحولت علماء الأعصاب لنموذج النظم التي يتم استخراج بسهولة أكبر من المعتكف من الأذن.
واحد من أنظمة نموذج هذه، وكييس من الضفدع الأمريكي (رنا catesbeiana)، كانت لعقود طويلة أثمرت فكرة تعميم إلى وظيفة جهاز سمعي والدهليزي. وكييس هو الجهاز مختلط وظيفة مع الأدوار الحسية في كل جلسة التردد المنخفض والإحساس الزلزالي. الخلايا الحسية من كييس هي خلايا الشعر لها، محولات الطاقة المتخصصة التي تحول الطاقة الميكانيكيةإلى إشارات كهربائية داخل أجهزتنا السمعية والدهليزي. إسقاط من السطح القمي كل خلية الشعر هو mechanosensitive ربطة الشعر التي تضم خصلة متدرجة من الزغيبات الصغيرة موسعة دعا أهداب ساكنة. مترابطة نصائح من أهداب ساكنة المجاورة من البروتينات الارتباط طرف الخيطية التي ميكانيكيا بوابة القنوات الأيونية في الاستجابة للمؤثرات الميكانيكية 2، 3. على الرغم من أن الأجهزة السمعية والدهليزي تستجيب لأنواع مختلفة من المحفزات، إلا أنهما يشتركان آلية الكشف المشتركة. هذه القواسم المشتركة راء العديد من الخبرات المكتسبة في mechanotransduction خلايا الشعر من خلال دراسات كييس الضفدع. على سبيل المثال، تمت دراسة عملية نشطة الخلية الشعر على نطاق واسع في هذا الجهاز 4، 5، 6، 7، وربطة الشعر توظف عملية مستهلكة للطاقة لانتاج الميكانيكيةعمل. وقد تبين ليس فقط أن خلايا الشعر تولد العمل النشط 6، ولكن تم كشف النقاب عن آليات متميزة الكامنة وراء عملية نشطة وخصائص ضبط خلية الشعر من خلال دراسات الضفدع acousticolateralis الأجهزة. وتشمل هذه النشطة الشعر حزمة الحركة (8) وخلية الشعر الرنين الكهربائي 9، 10، 11 في كييس والانتقائية تردد في الخلية الشعر المشبك الشريط 12 في حليمة البرمائيات.
كييس الضفدع وتناشد علماء الأعصاب الحسية لأسباب عديدة. وخلافا للالقوقعة الثدييات، هذا الجهاز تكمن داخل الكبسولة يمكن الوصول إليها بسهولة. ثانيا، يمكن خلايا الشعر داخل هذا الجهاز يبقى صحي لعدة ساعات في ظل ظروف مناسبة 13، 14. هذا يسمح experimentatأيون على هذه الخلايا على مدى فترات زمنية طويلة نسبيا مع نظرائهم الثدييات. ثالثا، الجهاز يحمل انحناء قليلا، والسماح سهولة التلاعب. رابعا، ويتألف كل جهاز من ألف أو أكثر من خلايا الشعر 15، وتوفير كل إنتاجية عالية واحتمال كبير لتحديد مجموعة مناسبة من خلايا الشعر لتجربة معينة. وأخيرا، هو تصور كييس الضفدع بسهولة نظرا لركاكة هذا الجهاز وحجم كبير من الخلايا شعره.
توفر هذه الخصائص مرونة كبيرة لدراسة الخلايا الحسية في كييس الضفدع ل. اعتمادا على هذه المسألة في يد واحدة من عدة الاستعدادات التجريبية يمكن الحصول عليها من كييس. وأبسط هذه هي إعداد-غرفة واحدة. هنا يجمد كييس في غرفة مليئة perilymph الاصطناعي، والمياه المالحة الغنية الصوديوم والكالسيوم عالية. هذا المستحضر يمكن دراسة التيارات خلية الشعر والميكانيكا ربطة الشعر الأساسية. والتكوين ثان، وإعداد من مجلسين، ويمكن استخدامها لدراسة الحركات ربطة الشعر عفوية. هنا يتعرض الجانب قمية من خلايا الشعر لالمالحة البوتاسيوم الغنية والكالسيوم الفقراء يسمى اللمف الجواني الاصطناعي، في حين أن استحم الجانب basolateral في perilymph الاصطناعي. هذين القسمين تحاكي الترتيب في الجسم الحي من ملاحات وتوفر بيئة تسمح حزم الشعر إلى التأرجح من تلقاء أنفسهم.
وصفنا في هذه الورقة إعداد كييس الضفدع لدراسة الفيزيائية الحيوية من خلايا الشعر الحسية لها. علينا أولا توفير تصوير مفصل لعزل هذا الجهاز من الأذن الداخلية الضفدعة. نحن ثم وصف كل من واحدة واثنين من غرفة الاستعدادات التجريبية وتشمل نتائج ممثل عن كل التكوين.
ضمن كييس الضفدع وتقع عدة آلاف من خلايا الشعر الحسية يسهل الوصول إليها. نحن هنا لشرح استخراج وإعداد كييس للتسجيلات واحدة واثنين من الغرفة. تسمح هذه الاستعدادات اثنين من كلتا الدراستين الميكرو ميكانيكية والكهربية للخلايا الشعر وحزم المرتبطة بها. لأن الأنسجة يمكن البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات مع استبدال متكررة من المياه المالحة غنية بالأوكسجين، قد تستمر التجارب لفترات طويلة. تبقى خلايا الشعر في هذه الاستعدادات عادة قابلا للتطبيق لتسجيل مسرى مكروي لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد تشريح، بينما تتأرجح حزم الشعر بشكل عفوي لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد الاستخراج.
استخراج ناجحة وتصاعد للكييس يتوقف على التغلب العديد من التحديات المشتركة. أولا، على اتصال مباشر مع السطح القمي من البقعة الكييس ينبغي تجنبها في جميع أنحاء الداخلي الإعداد. يوفر العصب الكيسي مقبض مريح لmanipu آمنlation من كييس. مرة واحدة الافراج عن بقية الأجهزة الداخلية الأذن، ينبغي نقل كييس باستخدام ماصة الجوف كبير في حين تبقى مغمورة في السوائل لتجنب الأضرار الميكانيكية لظهارة لها الحسية. يجب أن تكتمل إزالة غبار الأذن من سطح البقعة الصفراء دون الأضرار الميكانيكية للخلايا الشعر. لأن غبار الأذن تكمن مباشرة فوق البقعة، وخلايا الشعر يمكن أن تتضرر من جراء الاتصال العرضي بين أدوات تشريح وغشاء الحصيات السمعية أثناء إزالة غبار الأذن. لتجنب الضرر، ونحن نوصي بأن كتلة هلامية من غبار الأذن سيعقد في مكان بعيد عن البقعة وإزالتها ككتلة واحدة. هذا يتجنب تفتيت الكتلة otoconial إلى العديد من مجموعات، كل ذلك من شأنه أن يكون استخراجه بشكل فردي. إذا بقيت مجموعات صغيرة من غبار الأذن ويمكن إزالتها مع ضغط السائل لطيف بايدي ماصة باستور. ينطوي على التحدي الأخير تشكيل ختم ضيق بين ساحة كييس والألومنيوم تصاعد فيإعداد من مجلسين. توظيف مربع مع ثقب صغير بما يكفي للسماح للتداخل من حوالي 100 ميكرون بين كييس والمحيطة تصاريح الألومنيوم ختم كاملة من الأنسجة. وينبغي تقديم الغراء في اتصال مع ما يقرب من 100 ميكرون من الأنسجة الكييس حول محيط البقعة من أجل تشكيل ختم مشددة.
تركيز الكالسيوم الحرة 2+ اعتبار مهم في دراسة خلايا الشعر. كاليفورنيا 2+ ينظم التكيف السريع والبطيء على حد سواء، وبالتالي تحديد حركية الجهاز mechanotransduction وخصائص الظواهر عملية نشطة وربطة الشعر، بما في ذلك عفوية حزمة الحركة 8، 23. الكالسيوم اللمفي الباطن في الجسم الحي موجود في 250 ميكرومتر، وبالتالي يتم تقييم حركية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في هذا التركيز (مونسيل JHR، R. جاكوبس، وAJ Hudspeth. Unpublisالملاحظات هيد 16). ومع ذلك، تسجيلات مسرى مكروي من خلايا الشعر تتطلب تركيز الكالسيوم الخارجي تتجاوز 2 ملم لختم السليم للغشاء الخلوي حول مسرى مكروي. ولذلك فمن الضروري استخدام المياه المالحة عالية من الكالسيوم لهذه التجارب. وأخيرا، قد يرغب المرء لدراسة آثار الكالسيوم الخارجي على mechanotransduction باستخدام مجموعة متنوعة من تركيزات الكالسيوم. في هذه الحالات، من المهم أن نتذكر أن تركيزات الكالسيوم أقل من 1 ميكرومتر وعادة ما يؤدي إلى تمزق الارتباط طرف وخسارة لا رجعة فيها تنبيغ 28.
الاستعدادات التجريبية المذكورين هنا تسمح لمجموعة من القياسات الفيزيائية الحيوية في خلايا الشعر. ومع ذلك، قياسات إضافية يمكن إجراء تعديلات طفيفة على هذه الاستعدادات. في إعداد الكيسي مطوية، وتصور حزم الشعر أفقيا. التصوير الشعر حزمة الحركة من هذا المنطلق تكشف يذكره متماسكايون على المديين القصير وطويل القامة أهداب ساكنة 29. هنا يتم فصل البقعة الكييس أول من الأنسجة الكامنة ومطوية في وقت لاحق على طول محور يحددها العصب الكيسي بحيث حزم الشعر تواجه الخارج وتصور أفقيا في تجعد. والتعديل الثاني، تفكك خلايا الشعر، ويمكن دراسة كل من حزمة الخلية الشعر وسوما لها. وفصل خلايا الشعر ميكانيكيا على شريحة زجاجية للتصوير والكهربية تسجيل 30. وأخيرا، خلايا الشعر يمكن مقذوف من ظهارة باتباع بروتوكول تفكك مماثلة ولكن من دون خطوة التفكك الميكانيكية. هذه النتائج العلاج في خلايا الشعر الذي قذف تدريجيا من ظهارة، وتوفير الوصول basolateral عن التسجيلات الكهربية وتقليل الأضرار الميكانيكية. هذه الاستعدادات والعديد من التعديلات التي تدل على براعة كييس الضفدع كنظام نموذج لفيزيائيةدراسة خلايا الشعر الحسية.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |