Den amerikanske bullfrog s (Rana catesbeiana) sacculus tillader direkte undersøgelse af hår-celle fysiologi. Her dissektion og forberedelse af bullfrog s sacculus for biofysiske undersøgelser beskrives. Vi viser repræsentative eksperimenter fra disse hårceller, herunder beregning af et bundt s force-forskydning forhold og måling af dets utvungne bevægelse.
Studiet af hørelse og balance hviler på indsigt hentet fra biofysiske undersøgelser af modelsystemer. En sådan model, den sacculus af den amerikanske bullfrog, er blevet en grundpille i auditiv og vestibulær forskning. Undersøgelser af dette organ har afsløret, hvordan sensoriske celler hår kan aktivt detektere signaler fra omgivelserne. På grund af disse undersøgelser, vi nu bedre forstå den mekaniske gating og lokalisering af et hår celles transduktion kanaler, calcium rolle i mekanisk tilpasning, og identiteten af hår celle strømme. Denne meget tilgængelig orgel fortsætter med at give indsigt i arbejdet i hårceller. Her beskriver vi udarbejdelsen af bullfrog s sacculus for biofysiske undersøgelser af dens hårceller. Vi inkluderer den komplette dissektion procedure og giver specifikke protokoller til forberedelse af sacculus i bestemte sammenhænge. Vi inkluderer desuden repræsentative resultater ved hjælp af dette præparat, herunder beregning afet hår bundle øjeblikkelige kraft-forskydning forhold og måling af et bundt spontane oscillation.
De acousticolateralis organer af pattedyr i besiddelse af en kompleks arkitektur og ligger inden for en anatomisk niche, der kan være svært at få adgang. For eksempel den mammale cochlea omfatter en spiral labyrint og er indlejret i den tykke temporale knogle. Isolering af cochlea ofte forårsager mekanisk beskadigelse af sensoriske celler ligger inden den og har derfor vist sig at være en vanskelig opgave 1. Neuroforskere har således vendt til at modellere systemer, som er lettere ekstraheret fra sanctum af øret.
En af disse modelsystemer, den sacculus af den amerikanske bullfrog (Rana catesbeiana), har i årtier gav generaliseres indsigt i funktionen af auditive og vestibulære system. Den sacculus er et blandet funktion orgel med sensoriske roller i både lavfrekvente hørelse og seismisk sensation. De sensoriske celler i sacculus er dens hårceller, specialiserede transducere, der konverterer mekanisk energitil elektriske signaler inden for vores auditive og vestibulære organer. Rager ud fra den apikale overflade af hvert hår celle en mekanosensitive hår bundt, der omfatter en gradueret tot forstørret mikrovilli kaldet stereocilia. Spidserne af hosliggende stereocilia er indbyrdes forbundet med filamentøse tip-link proteiner, mekanisk gate ionkanaler som respons på mekanisk stimuli 2, 3. Selvom auditive og vestibulære organer reagerer på forskellige typer af stimuli, de deler en fælles afsløring mekanisme. Denne ensartethed ligger til grund for mange erfaringer, der opnås i hår-celle mechanotransduction gennem studier af bullfrog sacculus. For eksempel har håret cellens aktiv proces blevet omfattende undersøgt i dette organ 4, 5, 6, 7, og håret bundt anvender en energikrævende proces at fremstille mekaniskearbejde. Ikke alene er det blevet vist, at hårceller genererer aktivt arbejde 6, men distinkte mekanismer bag den aktive proces og et hår celles tuning karakteristika er blevet afsløret gennem studier af Bullfrog acousticolateralis organer. Disse omfatter aktive hår-bundt motilitet 8 og hår celle elektrisk resonans 9, 10, 11 i sacculus og frekvens selektivitet på håret cellens bånd synapse 12 i amfibiedyr papil.
Den bullfrog er sacculus appellerer til sensoriske hjerneforskere for mange grunde. I modsætning til pattedyr-cochlea, dette organ ligger inden for lettilgængelig otiske kapsel. For det andet kan hårceller i dette organ forbliver sunde i flere timer under passende betingelser 13, 14. Dette tillader experimentation på disse celler over lange tidsskalaer i forhold til deres pattedyr kolleger. For det tredje, orglet bærer lille krumning, tillader let manipulation. Fjerde, hvert organ omfatter en tusind eller flere hårceller 15, giver både en høj produktion og en høj sandsynlighed for at finde et passende sæt hårceller i en bestemt eksperiment. Endelig er det oksefrøen s sacculus let visualiseret grund tyndhed dette organ og store størrelse af sine hårceller.
Disse egenskaber giver stor alsidighed til studiet af sanseceller i oksefrøen s sacculus. Afhængig af spørgsmålet ved hånden, kan der opnås en af flere eksperimentelle præparater fra sacculus. Den simpleste af disse er den ene-kammer præparat. Her sacculus immobiliseres i et kammer fyldt med kunstig perilymfe, et natrium–rige og høj-calcium saltvand. Dette præparat muliggør studiet af hår celle strømme og grundlæggende hår bundle mekanik. En anden konfiguration, to-kammer-præparat, kan anvendes til undersøgelse af spontane hårbundt bevægelser. Her den apikale side af hårceller er udsat for en kalium-rige og calcium-fattig saltvand betegnes kunstig endolymfe, mens den basolaterale side er badet i kunstig perilymfe. Disse to rum efterligne in vivo arrangement af saltopløsninger og skabe et miljø, der tillader hårbundterne at oscillere spontant.
Vi beskriver i dette papir udarbejdelsen af bullfrog s sacculus for biofysisk undersøgelse af dets sensoriske hårceller. Vi først give en detaljeret skildring af isolering af dette organ fra frøen indre øre. Vi beskriver derefter både en- og to-kammer eksperimentelle præparater og omfatter repræsentative resultater for de forskellige konfigurationer.
Inden for bullfrog s sacculus ligge flere tusinde lettilgængelige sensoriske hårceller. Her demonstrerer vi udvinding og forberedelse af sacculus for en- og to-kammer optagelser. Disse to præparater tillader både mikromekaniske og elektrofysiologiske studier af hårceller og deres tilknyttede bundter. Fordi vævet kan overleve i flere timer med hyppig udskiftning af iltet saltvand, kan eksperimenter fortsætte i lange varigheder. Hår celler i disse præparater typisk forbliver levedygtige i mikroelektrode optagelse i op til seks timer efter dissektion, mens hår bundter svinger spontant i op til 24 timer efter ekstraktion.
Vellykket udvinding og montering af sacculus hængsler på overvinde flere fælles udfordringer. Først bør undgås direkte kontakt med den apikale overflade af Sækformet macula hele fremstillingsproceduren. Den Sækformet nerve giver en praktisk håndtag til sikker manipuning af sacculus. Når befriet fra resten af de indre-øre organer, bør sacculus overføres ved anvendelse af en stor boring pipette, mens de resterende nedsænket i væske for at undgå mekanisk beskadigelse af dets sensoriske epithel. Fjernelsen af otoconia fra makulært overflade skal være afsluttet uden mekaniske skader på hårceller. Fordi otoconia ligger direkte oven på gule plet, kan hårceller blive beskadiget af utilsigtet kontakt mellem dissektion værktøjer og den otolithic membran, mens du fjerner otoconia. For at undgå skader, anbefaler vi, at der afholdes den gelatinøse masse otoconia på et sted langt fra den gule plet og fjernes som en enkelt masse. Derved undgår opsplitning af det otoconial masse i talrige klynger, som hver især vil blive individuelt udtrukket. Hvis små klynger af otoconia forbliver de kan fjernes med blide væsketryk leveret af en Pasteur-pipette. En sidste udfordring involverer dannelsen af en tæt forsegling mellem sacculus og aluminium montering ligge ito-kammer præparat. Anvender en firkant med en perforering lille nok til at tillade overlapning på ca. 100 um mellem sacculus og de omgivende aluminium tillader fuldstændig forsegling af vævet. Limen bør bringes i kontakt med ca. 100 um af Sækformet væv omkring macula perimeter for at danne en tæt forsegling.
Koncentrationen af frit Ca2 + er en vigtig overvejelse i studiet af hårceller. Ca2 + regulerer både hurtig og langsom tilpasning og bestemmer således kinetikken for mechanotransduction apparater samt egenskaber for håret bundle aktive-proces fænomener, herunder spontan bundt bevægelighed 8, 23. Endolymfatisk calcium in vivo er til stede ved 250 uM, derfor de mest fysiologisk relevant kinetik vurderes ved denne koncentration (Maunsell JHR, R. Jacobs, og AJ Hudspeth. UnpublisHED observationer 16). Imidlertid mikroelektrode optagelser fra hårceller kræve en ekstern calcium koncentration over 2 mM for korrekt tætning af den cellulære membran omkring mikroelektrode. Det er derfor bydende nødvendigt at bruge en høj-calcium saltvand i disse eksperimenter. Endelig kan man ønsker at studere virkningerne af ekstern calcium upon mechanotransduction ved hjælp af forskellige calcium-koncentrationer. I disse tilfælde er det vigtigt at huske, at calcium koncentrationer under 1 uM typisk føre til tip-link brud og uoprettelige tab af transduktion 28.
De to eksperimentelle præparater beskrevet her mulighed for en række biofysiske målinger på hårceller. Dog kan yderligere målinger foretages med mindre ændringer af disse præparater. I den foldede Sækformet fremstilling er hårbundterne visualiseret lateralt. Imaging hår-bundle bevægelse fra dette udsigtspunkt afslører sammenhængende motion af både korte og høje stereocilia 29. Her Sækformet macula skilles først fra dens underliggende væv og efterfølgende foldes langs aksen defineret af Sækformet nerve, således at hårbundterne vender udad og visualiseres lateralt på folden. En anden modifikation, hår-celle dissociation, muliggør studiet af både hår cellens bundt og dens soma. Hårceller mekanisk dissocieret på en glasplade for billedbehandling og elektrofysiologiske optagelse 30. Endelig kan hårceller ekstruderes fra epithelet ved at følge en lignende dissociation protokollen, men uden den mekaniske dissociation trin. Denne behandling resulterer i hårceller som gradvis ekstruderes ud af epitelet, der giver basolaterale adgang for elektrofysiologiske optagelser samtidig minimere mekaniske skader. Disse præparater og deres mange modifikationer demonstrerer alsidigheden af frøen sacculus som et modelsystem til biofysiskeundersøgelse af sansehårceller.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |