Die amerikanischen Ochsenfrosches ist (Rana catesbeiana) sacculus ermöglicht die direkte Untersuchung von Haarzellphysiologie. Hier ist die Präparation und Vorbereitung der sacculus des Ochsenfrosch für biophysikalische Studien beschrieben. Wir zeigen repräsentative Experimente aus diesen Haarzellen, einschließlich der Berechnung eines Bündels der Kraft-Weg-Beziehung und Messung seiner ungezwungenen Bewegung.
Die Studie von Hör- und Gleichgewichts beruht auf Erkenntnissen aus biophysikalischen Studien von Modellsystemen gezogen. Ein solches Modell, das sacculus des amerikanischen Ochsenfrosches, hat eine tragende Säule des Hör- und Gleichgewichtsforschung. Studien dieses Organs haben gezeigt, wie Sinneszellen Haare aktiv Signale aus der Umgebung erfassen kann. Aufgrund dieser Untersuchungen haben wir nun ein besseres Verständnis der mechanischen Gating und Lokalisierung eines Transduktionskanäle Haarzelle, Kalzium Rolle in der mechanischen Bearbeitung, und die Identität der Haarzellströme. Das leicht zugängliche Organ weiterhin Einblick in die Funktionsweise von Haarzellen zu liefern. Hier beschreiben wir die Vorbereitung der sacculus des Ochsenfrosch für biophysikalische Studien über seine Haarzellen. Wir sind das komplette Dissektion Verfahren und bieten spezielle Protokolle für die Vorbereitung des sacculus in spezifischen Kontexten. Wir verfügen zusätzlich über repräsentative Ergebnisse dieser Zubereitung, einschließlich der Berechnung voneine momentane Kraft-Weg-Haarbündel Beziehung und Messung des Erfolgs einer spontanen Schwingung des Bundles.
Die acousticolateralis Organe von Säugetieren besitzen eine komplexe Architektur und liegen innerhalb einer anatomischen Nische, die nur schwer zugänglich sein kann. Zum Beispiel umfasst die Säugetier-Cochlea mit einer spiralförmigen Labyrinth und ist innerhalb der dicken zeitlichen Knochen eingebettet. Die Isolierung der Cochlea führt oft zu mechanischen Schäden an den Sinneszellen in ihm liegen und hat daher eine schwierige Aufgabe 1 erwiesen. Neurowissenschaftler haben so gedreht Systeme zu modellieren, die sich leichter aus der sanctum des Ohres extrahiert.
Eines dieser Modellsysteme, die sacculus des amerikanischen Ochsenfrosches (Rana catesbeiana), ist seit Jahrzehnten verallgemeinerbar Einblick in die Funktion des Hör- und Gleichgewichtssysteme ergab. Die sacculus ist ein Mixed-Funktion Orgel mit sensorischen Rollen in beiden niederfrequenten Gehör und seismische Sensation. Die Sinneszellen des sacculus sind die Haarzellen, spezialisierte Wandler, die mechanische Energie umwandelnin elektrische Signale innerhalb unserer Hör- und Gleichgewichtsorgane. Projizieren von der apikalen Oberfläche jeder Haarzelle ist ein mechanosensitive Haarbündel, das einen abgestuften Büschel vergrößerte Mikrovilli genannt stereocilia umfasst. Die Spitzen benachbarter Stereozilien werden durch filamentöse Spitze-link Proteine miteinander verbunden , die mechanisch Gate Ionenkanälen in Reaktion auf mechanische Reize 2, 3. Obwohl Hör- und Gleichgewichtsorgane auf verschiedene Arten von Stimuli reagieren, sie ein gemeinsames Detektionsmechanismus teilen. Diese Gemeinsamkeit zugrunde liegt, die vielen Einsichten Haarzelle Mechanotransduktion durch Studien des Ochsenfrosch sacculus gewonnen in. Zum Beispiel ist der aktive Prozess der Haarzelle wurde ausgiebig in diesem Organ 4 untersucht, 5, 6, 7, und das Haarbündel verwendet einen energieaufwendigen Prozess mechanisch zu produzierenArbeit. Nicht nur hat es sich gezeigt , dass Haarzellen aktive Arbeit 6, erzeugen aber verschiedene Mechanismen den aktiven Prozess zugrunde liegen und ein Tuning – Eigenschaften der Haarzelle haben durch Studien von Bullfrog acousticolateralis Organe enthüllt. Dazu gehören aktive Haarbündel Motilität 8 und Haarzelle elektrische Resonanz 9, 10, 11 in der sacculus und Frequenzselektivität bei der Bandsynapse der Haarzelle 12 in der Amphibie Papille.
Die Ochsenfrosch des sacculus spricht sensorischen Neurowissenschaftler aus mehreren Gründen. Im Gegensatz zu den Säugetieren Cochlea, liegt dieses Organ in der leicht zugänglichen Ohrkapsel. Zweitens Haarzellen innerhalb dieses Organ kann für mehrere Stunden unter geeigneten Bedingungen 13 gesund bleiben, 14. Dies ermöglicht experimentatIonen auf diese Zellen über lange Zeiträume relativ zu ihren Säugetier-Gegenstücke. Drittens trägt das Organ wenig Krümmung, eine einfache Handhabung ermöglicht. Viertens weist jedes Organ tausend oder mehr Haarzellen 15, die beide einen hohen Durchsatz und eine hohe Wahrscheinlichkeit der Lokalisierung eines geeigneten Satzes von Haarzellen für ein gegebenes Experiment bereitstellt. Schließlich wird die Ochsenfrosch des sacculus leicht aufgrund der geringen Dicke dieses Organs und große Größe der Haarzellen sichtbar gemacht.
Diese Eigenschaften bieten große Vielseitigkeit für die Untersuchung der Sinneszellen innerhalb der Ochsenfrosch des sacculus. Je nach Fragestellung, einer von mehreren Versuchspräparate können aus der sacculus erhalten werden. Die einfachste davon ist die Einkammer-Zubereitung. Hier ist die sacculus in einer Kammer immobilisiert gefüllt mit artifizieller Perilymphe, eine natriumreiche und hochCalciumSalzLösung. Diese Herstellung ermöglicht die Untersuchung von Haarzellströme und grundlegende Haarbündel Mechanik. Eine zweite Konfiguration ist der Zweikammer-Zubereitung, verwendet werden spontane Haarbündel Bewegungen zu studieren. Hier ist der apikalen Seite der Haarzellen ausgesetzt ist, zu einer kaliumreichen und kalkarmen Saline genannt künstliche Endolymphe, während der basolateralen Seite in artifizieller Perilymphe gebadet wird. Diese beiden Kammern imitieren die in – vivo – Anordnung von Salinen und ein Umfeld schaffen , das Haarbündel spontan zu schwingen können.
Wir beschreiben in diesem Papier die Vorbereitung des sacculus des Ochsenfrosch für biophysikalische Untersuchung ihrer sensorischen Haarzellen. Wir bieten zunächst eine detaillierte Darstellung der Isolierung dieses Organ aus dem Innenohr des Frosches. Wir beschreiben dann sowohl die Ein- und Zwei-Kammer experimentelle Präparate und umfassen repräsentative Ergebnisse für jede Konfiguration.
Innerhalb der sacculus des Ochsenfrosch liegen mehrere tausend leicht zugängliche Sinneshaarzellen. Hier zeigen wir Gewinnung und Aufbereitung des sacculus für Ein- und Zweikammer-Aufnahmen. Diese beiden Präparate erlauben sowohl mikromechanischen und elektrophysiologische Untersuchungen von Haarzellen und ihre zugehörigen Bundles. Da das Gewebe für mehrere Stunden mit häufigen Austausch von Sauerstoff angereicherte Salz überleben können, können Experimente für längere Zeit fortgesetzt werden. Haarzellen in diesen Zubereitungen bleiben typischerweise fähig Mikroelektrodenaufzeichnung für bis zu 6 h nach der Sektion, während Haarbündel schwingen spontan bis zu 24 h nach der Extraktion.
Erfolgreiche Gewinnung und Lagerung der sacculus Scharniere auf mehrere gemeinsame Herausforderungen überwinden. Zunächst direkten Kontakt mit der apikalen Oberfläche der saccular Macula sollten während des Herstellungsverfahrens vermieden werden. Der saccular Nerv bietet einen bequemen Griff für sicheres Manipu-nung des sacculus. Einmal von dem Rest der Innenohrorgane befreit, sollte die sacculus mit einem großkalibrigen Pipette übertragen werden, während in der Flüssigkeit eingetaucht verbleibt, mechanische Beschädigung seiner Sinnesepithel vermeiden. Die Entfernung von otoconia von der Makula-Oberfläche ohne mechanische Schäden an Haarzellen abgeschlossen sein. Da die otoconia direkt oben auf der Makula liegen, Haarzellen können durch versehentlichen Kontakt zwischen Dissektionswerkzeuge und der otolithic Membran beim Entfernen otoconia beschädigt werden. Um Schäden zu vermeiden, empfehlen wir, dass die Gallerte von otoconia an einem Ort gehalten werden, weit weg von der Makula und als eine einzige Masse entfernt. Dies vermeidet die Fragmentierung der otoconial Masse in zahlreiche Cluster, von denen jeder einzeln extrahiert werden würde. Wenn kleine Gruppen von otoconia bleiben können sie mit sanften Flüssigkeitsdruck durch eine Pasteur-Pipette geliefert entfernt werden. Eine letzte Herausforderung beinhaltet die Bildung einer dichten Abdichtung zwischen dem sacculus und Aluminium Montageplatz in derZweikammer Vorbereitung. Der Einsatz eines Quadrats mit einer Perforation klein genug Überlappung von etwa 100 & mgr; m zwischen dem sacculus und die umliegenden Aluminium ermöglicht eine vollständige Abdichtung des Gewebes zu ermöglichen. Der Kleber sollte mit etwa 100 & mgr; m von saccular Gewebe um die Makula Perimeter, um in Kontakt gebracht werden, um eine dichte Abdichtung zu bilden.
Die Konzentration an freiem Ca 2+ ist ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Untersuchung von Haarzellen. Ca 2+ reguliert sowohl schnelle als auch langsame Anpassung, damit die Kinetik der Mechanotransduktion Vorrichtung und die Eigenschaften des Haarbündels aktive Prozessphänomene bestimmen, einschließlich spontaner Bündelbewegungs 8, 23. Endolymphatischer Calcium in vivo ist bei 250 & mgr; M vorhanden, deshalb werden die meisten physiologisch relevanten Kinetik bei dieser Konzentration bewertet werden (Maunsell JHR, R. Jacobs und AJ Hudspeth. Unpublished Beobachtungen 16). Jedoch Mikroelektrodenaufzeichnungen von Haarzellen erfordern eine externe Calciumkonzentration von mehr als 2 mM für eine einwandfreie Abdichtung der Zellmembran um die Mikroelektrode. Es ist daher zwingend notwendig, eine hohe Calcium-Salzlösung für diese Versuche zu verwenden. Schließlich kann man wünschen, die Auswirkungen von externen Kalzium auf Mechanotransduktion zu studieren eine Vielzahl von Calciumkonzentrationen verwendet. In diesen Fällen ist es wichtig , dass Kalzium – Konzentrationen unter 1 uM führen typischerweise zu Spitze-Link Bruch und irreversiblen Verlust der Übertragungs 28 zu erinnern.
Die beiden Versuchsansätze hier beschrieben ermöglichen eine Reihe von biophysikalischen Messungen an Haarzellen. Allerdings können zusätzliche Messungen mit leichten Modifikationen an diesen Vorbereitungen getroffen werden. In der gefalteten saccular Vorbereitung, Haarbündel seitlich sichtbar gemacht. Imaging Haarbündel Bewegung von diesem Aussichtspunkt zeigt kohärente motIon sowohl kleine als auch große stereocilia 29. Hier ist die saccular Makula wird zunächst von seinem darunterliegenden Gewebe abgetrennt und anschließend entlang der Achse gefaltet durch die saccular Nerven so definiert, dass Haarbündel liegen nach außen und sind seitlich am Knick sichtbar gemacht. Eine zweite Modifikation, Haar-Zell-Dissoziation, ermöglicht die Untersuchung sowohl des Bündels Haarzelle und seine soma. Haarzellen sind auf einem Glasobjektträger für die Bildgebung und elektro Aufnahme 30 mechanisch dissoziiert. Schließlich können Haarzellen aus dem Epithel extrudiert werden durch ein ähnliches Dissoziation Protokoll folgend, aber ohne die mechanischen Dissoziierungsschritt. Diese Behandlung führt zu Haarzellen, die aus dem Epithel allmählich extrudieren, basolateralen Zugang für elektrophysiologischen Ableitungen bietet, während eine mechanische Beschädigung zu minimieren. Diese Präparate und ihre vielen Modifikationen zeigen die Vielseitigkeit des Frosches sacculus als Modellsystem für die biophysikalischenStudie von Sinneshaarzellen.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |