ウシガエルの( ウシガエル )球形嚢毛細胞生理学の直接検査を可能にします。ここで解剖し、生物物理学的研究のためのウシガエルの球形嚢の調製が記載されています。私たちは、その自発的運動の束の力 – 変位関係の計算と測定を含むこれらの有毛細胞からの代表的な実験を示します。
聴覚とバランスの研究では、モデル系の生物物理学的研究から引き出された洞察に載ります。そのようなモデルでは、ウシガエルの球形嚢は、聴覚と前庭研究の主力となっています。この器官の研究が積極的に環境からの信号を検出することができますどのように感覚細胞髪を明らかにしました。そのため、これらの研究のため、我々は今より良好な機械的ゲーティングと有毛細胞の形質導入チャネル、機械的な適応におけるカルシウムの役割の局在、および有毛細胞電流のアイデンティティを理解しています。この非常にアクセス可能な臓器は、有毛細胞の働きへの洞察を提供し続けています。ここでは、その毛細胞上の生物物理学的研究のためのウシガエルの球形嚢の調製を記載します。我々は完全な解剖の手順が含まれており、特定のコンテキストで球形嚢の調製のための特定のプロトコルを提供します。我々はさらに、の計算を含む本製剤を使用して代表的な結果を含みますバンドルの自発的な振動の毛束の瞬発力 – 変位関係と測定。
哺乳類のacousticolateralis器官は複雑な構造を有し、アクセスが困難であることができる解剖学的ニッチ内にあります。例えば、哺乳動物の蝸牛は螺旋状迷路を含み、厚い側頭骨の中に埋め込まれています。蝸牛の単離は、しばしば内にある感覚細胞の機械的損傷を引き起こし、したがって、困難なタスク1であることが判明しています。神経科学者は、より容易に耳の聖域から抽出されたシステムをモデル化するためになっています。
これらのモデル系の一つ、アメリカウシガエル( ウシガエル )の球形嚢は、何十年も聴覚と前庭系の機能に一般化洞察をもたらしました。球形嚢は、低周波の聴力や地震感覚の両方における感覚の役割を持つ混合機能器官です。球形嚢の感覚細胞は、その有毛細胞、機械的エネルギーに変換する特殊なトランスデューサです私たちの聴覚と前庭器官内の電気信号に変換します。各有毛細胞の頂端面から突出することは不動と呼ばれる拡大微絨毛の傾斜房を備える機械受容毛束です。隣接不動毛の先端は、機械的刺激2,3に応答して機械的にゲートイオンチャネル糸状先端リンクタンパク質によって相互接続されています。聴覚と前庭器官が刺激の異なる種類に反応するが、これらは一般的な検出メカニズムを共有しています。この共通点は、ウシガエルの球形嚢の研究によって毛細胞のメカノに得られた多くの知見の下にあります。例えば、有毛細胞の能動的プロセスは、この臓器4、5、6、7で広く研究されており、毛束は、機械製造するためにエネルギーを消費するプロセスを採用します作業。だけでなく、有毛細胞が活性ワーク6を生成することが示されているが、個別のアクティブなプロセスのメカニズムや有毛細胞の同調特性は、臓器acousticolateralisウシガエルの研究によって発表されました。これらは両生類乳頭内有毛細胞のリボンシナプス12で球形嚢と周波数選択性で11、10、アクティブ毛束の運動性8と有毛細胞の電気的共振9が含まれます。
ウシガエルの球形嚢は多くの理由のために、感覚神経科学者に訴えます。哺乳動物の蝸牛とは異なり、この器官は、容易にアクセス可能な耳用カプセル内にあります。第二に、この器官内の有毛細胞は、適切な条件13、14下に数時間、健康を維持することができます。これはexperimentatを許可します彼らの哺乳類の対応に比較的長い時間スケールにわたって、これらの細胞上でのイオン。第三に、臓器は、容易な操作を可能にして、少し湾曲を負いません。第四に、各器官は、高スループット、所定の実験に有毛細胞の適切なセットを配置する高い確率の両方を提供する、数千以上の有毛細胞15を含みます。最後に、ウシガエルの球形嚢を簡単に、その有毛細胞のこの器官と大きなサイズの薄さに可視化されます。
これらのプロパティは、ウシガエルの球形嚢内の感覚細胞の研究のための優れた汎用性を提供します。当面の問題に応じて、いくつかの実験的な製剤の一つが球形嚢から得ることができます。これらのうち最も簡単なものは、1室の準備です。ここでは球形嚢は、人工外リンパ、ナトリウムが豊富な、高カルシウム生理食塩水で満たされたチャンバ内に固定化されています。この準備は、有毛細胞電流および基本的な毛束の力学の研究を可能にします。第二の構成、二室の調製は、自発的な毛束の動きを研究するために使用することができます。ここでは有毛細胞の頂端側はカリウムが豊富でカルシウムに乏しい生理食塩水にさらされている側底側は人工外リンパを浴びれるのに対し、人工内リンパと呼ばれます。これら二つの区画には、生理食塩水のin vivoでの配置を模倣し、毛束が自然に振動することを可能にする環境を提供します。
本稿ではその感覚有毛細胞の生物物理学的研究のためのウシガエルの球形嚢の調製を記載します。私たちは、最初のカエルの内耳からこの器官の分離の詳細な描写を提供します。私たちは、その後、1次元と2室の実験準備の両方を説明し、各構成の代表的な結果が含まれています。
ウシガエルの球形嚢の中で数千簡単にアクセス可能な感覚有毛細胞をうそ。ここでは、1次元と2室の録音のための抽出と球形嚢の製造を実証します。これらの2つの調製物は、有毛細胞の微小機械および電気生理学的研究とその関連のバンドルの両方を可能にします。組織が酸素化生理食塩水の頻繁な交換で数時間生存することができるので、実験が長時間継続することができます。毛束が抽出後24時間までのために自然に振動しながら、これらの調製物中の有毛細胞は、典型的には、解剖後最大6時間の微小電極記録のために生き続けます。
球形嚢の抽出成功と実装はいくつかの共通の課題を乗り越える時にかかっています。まず、嚢状黄斑の先端面との直接接触は、調製手順を通して避けるべきです。嚢状神経は安全manipuに便利なハンドルを提供します球形嚢のレーション。内耳器官の残りの部分から解放されると、その感覚上皮への機械的な損傷を避けるために、流体中に浸漬されたまま、球形嚢は、大口径のピペットを使用して転送する必要があります。黄斑表面から聴砂の除去は、有毛細胞の機械的な損傷を与えることなく完了する必要があります。聴砂は、黄斑の上に直接横たわるので聴砂を除去しながら、有毛細胞は、解剖ツールと耳石膜との間の偶発的な接触によって損傷することができます。損傷を避けるために、我々は聴砂のゼラチン状の塊が黄斑から遠く離れた場所で開催し、単一の質量として除去することをお勧めします。これは、個別に抽出されるであろう、それぞれが多数のクラスタにotoconial質量の断片化を回避することができます。聴砂の小さな塊が残っている場合、それらはパスツールピペットにより送達穏やか流体圧を用いて除去することができます。最後の課題は、中の球形嚢とアルミニウム取付広場の間に密封シールの形成を含みます二チャンバー製剤。約100μm球形嚢と周囲のアルミ許可組織の完全なシールとの間の重複を可能にするのに十分に小さい穿孔の正方形を採用。接着剤は、密封を形成するために約100μm黄斑の周囲に嚢状の組織に接触すべきです。
遊離Ca 2+の濃度は、有毛細胞の研究における重要な考慮事項です。 Ca 2+がこのように自発的なバンドルモーション8、23を含むメカノ装置の動態と毛束のアクティブなプロセス現象の特性を決定する、高速と低速の両方の適応を調節します。 in vivoでの内リンパカルシウムは、したがって、最も生理学的に関連する速度はこの濃度(Maunsell JHR、R.ジェイコブス、およびAJ Hudspethで評価され、250μMで存在する。UnpublisHED観測16)。しかし、有毛細胞からの微小電極記録は、微小電極の周りの細胞膜の適切なシーリングのため2ミリメートルを超える外部のカルシウム濃度を必要とします。これらの実験のために、高カルシウムの生理食塩水を使用することが必須です。最後に、1は、カルシウム濃度のさまざまな方法を使ってメカノた際に、外部のカルシウムの効果を研究することもできます。これらのケースでは、1μM以下のカルシウム濃度は、典型的には、先端リンク破裂および伝達28の不可逆的損失につながることを覚えておくことが重要です。
ここで説明する2つの実験の製剤は、有毛細胞上の生物物理学的測定値の範囲を可能にします。しかし、追加の測定は、これらの調製物にわずかな改変を行うことができます。折り畳まれた嚢状の準備では、毛束が横方向に可視化されます。この視点からイメージング毛束の動きは、コヒーレント名言を明らかに短いと背の高い不動29の両方のイオン。ここで嚢状黄斑は、最初にその下にある組織から分離し、続いて毛束が外側に面しており、しわに横方向に可視化されるように嚢状神経によって定義された軸に沿って折り畳まれます。第2の変形例、毛細胞解離は、有毛細胞のバンドルとそのソーマの両方の研究を可能にします。有毛細胞は、機械的に画像化し、電気生理学的記録30用ガラススライド上に分離されています。最後に、有毛細胞は、同様の解離プロトコルを以下ではなく、機械的解離工程なし上皮から押し出すことができます。機械的損傷を最小限に抑えながら、徐々に電気生理学的記録のための基底外側のアクセスを提供し、上皮の外に押し出す有毛細胞におけるこの治療の結果。これらの製剤およびそれらの多くの変更は、生物物理学的のためのモデル系としてカエルの球形嚢の汎用性を実証します感覚毛細胞の研究。
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |