Den amerikanska Bullfrog s (Ranacatesbeiana) säcken tillåter direkt undersökning av hår-cellfysiologi. Här dissekering och beredning av Bullfrog är säcken för biofysiska studier beskrivs. Vi visar representativa experiment från dessa hårceller, inklusive beräkning av en bunt på kraftförskjutnings förhållande och mätning av dess otvungen rörelse.
Studiet av hörsel och balans vilar på insikter dras från biofysiska studier av modellsystem. En sådan modell, säcken av den amerikanska Bullfrog, har blivit en stöttepelare för hörsel- och vestibulära forskning. Studier av detta organ har avslöjat hur sensoriska celler hår kan aktivt detektera signaler från omgivningen. På grund av dessa studier, har vi nu bättre förstå den mekaniska grind och lokalisering av ett hår cellens överföringskanaler, kalcium roll i mekanisk anpassning, och identiteten av hår cellströmmar. Denna mycket tillgängliga organ fortsätter att ge insikt i hur hårcellerna. Här beskriver vi framställningen av Bullfrog är säcken för biofysiska studier på dess hårcellerna. Vi inkluderar hela dissektion förfarande och ger särskilda protokoll för framställning av säcken i specifika sammanhang. Vi inkluderar dessutom representativa resultat med detta preparat, inklusive beräkning avett hår bunt momentana kraftförskjutnings förhållande och mätning av en bunt spontana svängning.
De acousticolateralis organ däggdjur har en komplex arkitektur och ligger inom en anatomisk nisch som kan vara svåra att komma åt. Till exempel innefattar däggdjurs snäckan en spiral labyrint och är inbäddad i den tjocka tinningbenet. Isolering av koklea orsakar ofta mekanisk skada på sinnesceller som ligger inom det och har därför visat sig vara en svår uppgift 1. Neuroforskare har alltså vänt för att modellera system som är mera lätt extraheras från kärna i örat.
En av dessa modellsystem, i säcken av den amerikanska oxgroda (Ranacatesbeiana), har i årtionden gett generaliserbar insikt funktionen hos hörsel och balansorgan. Den säcken är en blandad funktion orgel med sensoriska roller i både lågfrekvent hörsel och seismiska sensation. De sinnesceller i säcken är dess hårceller, specialiserade omvandlare som omvandlar mekanisk energitill elektriska signaler inom våra hörsel och vestibulära organ. Utskjutande från den apikala ytan på varje hårceller är en mechanosensitive hår bunt som innefattar en graderad tofs av förstorad mikrovilli kallas stereocilier. Spetsarna på intilliggande sinneshår är sammankopplade genom tråd tip-link proteiner som mekaniskt gate jonkanaler som svar på mekanisk stimuli 2, 3. Även hörbara och vestibulära organ svarar på olika typer av stimuli, de delar en gemensam mekanism upptäckt. Denna gemensamhet ligger till grund för de många insikter i hår-cells mechanotransduction genom studier av Bullfrog säcken. Till exempel, har håret cellens aktiv process studerats i stor utsträckning i detta organ 4, 5, 6, 7, och håret bunt utnyttjar en energikrävande process för att producera mekaniskarbete. Inte bara har det visat sig att hårceller generera aktivt arbete 6, men tydliga mekanismer som ligger bakom den aktiva processen och ett hår cellens tuning egenskaper har avtäckt genom studier av Bullfrog acousticolateralis organ. Dessa innefattar aktiva hår-bunt motilitet 8 och hårceller elektrisk resonans 9, 10, 11 i säcken och selektivitet frekvens vid håret cellens band synaps 12 i amfibie papillen.
Bullfrog är säcken tilltalar sensoriska neuroforskare för många skäl. Till skillnad från däggdjur snäckan, ligger detta organ inom den lättillgänglig öron kapsel. För det andra, kan hårcellerna i detta organ förblir friska under flera timmar under lämpliga förhållanden 13, 14. Detta tillåter experimentatjon på dessa celler över långa tidsperioder i förhållande till deras däggdjurs motsvarigheter. För det tredje, bär organ lilla krökningen, medger enkel hantering. För det fjärde innefattar varje organ tusen eller flera hårceller 15, som ger både en hög genomströmning och en hög sannolikhet för att lokalisera en lämplig uppsättning hårceller för ett givet experiment. Slutligen oxgroda s säcken lätt visualiseras på grund av den tunnhet i detta organ och stora storleken på dess hårceller.
Dessa egenskaper ger stor mångsidighet för studier av sensoriska celler i Bullfrog är säcken. Beroende på frågan till hands, kan en av flera experimentella preparat erhållas från säcken. Den enklaste av dessa är den en-kammar beredning. Här säcken är fixerad i en kammare fylld med artificiell perilymfa, en natrium-rik och hög kalcium saltlösning. Denna beredning möjliggör studier av hår cellströmmar och grundläggande hår bunt mekanik. En andra konfiguration, den två-kammar beredning kan användas för att studera spontana hårknippet rörelser. Här den apikala sidan av hårceller utsätts för en kalium rik och kalcium fattiga saltlösning kallas artificiell endolymfan, medan den basolaterala sidan badar i artificiell perilymfa. Dessa två fack härma arrangemanget in vivo av saltlösningar och ger en miljö som tillåter hårknippena att oscillera spontant.
Vi beskriver i detta dokument beredningen av Bullfrog är säcken för biofysiska studier av dess sensoriska hårceller. Vi tillhandahåller först en detaljerad skildring av isolering av detta organ från grodans innerörat. Vi beskriver sedan både en- och två-kammar experimentella preparat och inkluderar representativa resultat för varje konfiguration.
Inom Bullfrog är säcken ligger flera tusen lättillgängliga sensoriska hårceller. Här visar vi utvinning och beredning av säcken för en- och två-kammar inspelningar. Dessa två preparat tillåter både mikromekaniska och elektrofysiologiska studier av hårceller och tillhörande buntar. Eftersom vävnaden kan överleva i flera timmar med frekvent utbyte av syresatt saltlösning, kan experiment fortsätta för långa löptider. Hårcellerna i dessa förberedelser är fortfarande typiskt lönsamt för mikro inspelning för upp till 6 timmar efter dissektion, medan hårknippena svänga spontant upp till 24 timmar efter extraktion.
Framgångsrik utvinning och montering av säcken hänger på vinna flera gemensamma utmaningar. För det första bör direkt kontakt med den apikala ytan av den saccular makula undvikas under hela förfarandet beredning. Den saccular nerv ger ett bekvämt handtag för säker manipuning av säcken. När befrias från resten av innerörat organ bör säcken överföras med hjälp av en stor öppning pipett samtidigt som den är nedsänkt i vätska för att undvika mekaniska skador på dess sensoriska epitel. Avlägsnandet av otoconia från macular yta måste fyllas utan mekanisk skada hårcellerna. Eftersom otoconia ligga direkt ovanpå macula, kan hårcellerna skadas av oavsiktlig kontakt mellan dissektion verktyg och otolithic membranet när du tar bort otoconia. För att undvika skador, rekommenderar vi att gelatinös massa av otoconia hållas på en plats långt från gula fläcken och avlägsnas som en enda massa. Detta undviker fragmentering av den otoconial massan i flera kluster, vilka var och en skulle vara individuellt extraherade. Om små kluster av otoconia förblir de kan tas bort med mild vätsketryck som levereras av en Pasteur-pipett. En slutlig utmaning innefattar bildningen av en tät tätning mellan säcken och aluminium montering fyrkant iberedning två kammare. Användning av en fyrkant med en perforering tillräckligt liten för att tillåta överlappning av omkring 100 | im mellan säcken och de omgivande aluminium medger fullständig tätning av vävnaden. Limmet bör bringas i kontakt med ca 100 | j, m av saccular vävnad runt gula fläcken omkrets för att bilda en tät försegling.
Koncentrationen av fri Ca 2+ är en viktig faktor i studien av hårceller. Ca 2 + reglerar både snabb och långsam anpassning, sålunda bestämmer kinetiken hos mechanotransduction apparaten och egenskaperna hos håret bunt aktiva-process fenomen, inbegripet spontan bunt rörelse 8, 23. Endolymphatic kalcium in vivo är närvarande vid 250 ^ M, därför mest fysiologiskt relevant kinetik bedöms vid denna koncentration (Maunsell JHR, R. Jacobs och AJ Hudspeth. UnpublisHed observationer 16). Men mikroelektrod inspelningar från hårcellerna kräver en extern kalciumkoncentration för korrekt tätning av cellmembranet kring mikro högst 2 mm. Det är därför absolut nödvändigt att använda en hög-kalcium saltlösning för dessa experiment. Slutligen kan man önska att studera effekterna av externt kalcium vid mechanotransduction med hjälp av olika kalciumkoncentrationer. I dessa fall är det viktigt att komma ihåg att kalciumkoncentrationer under 1 uM typiskt leda till spets-link bristning och oåterkallelig förlust av överföring 28.
De två experimentella beredningar som beskrivs här möjliggöra ett intervall av biofysikaliska mätningar på hårcellerna. Emellertid kan ytterligare mätningar göras med smärre ändringar av dessa preparat. I den vikta saccular beredningen är hårknippena visualiseras i sidled. Imaging hår-bunt rörelse från denna utsiktspunkt avslöjar sammanhängande MOTjon av både kort och lång stereocilier 29. Här saccular makula skiljs först från dess underliggande vävnad och därefter viks längs axeln som definieras av saccular nerven så att hårknippena ansikte utåt och visualiseras i sidled vid vecket. En andra modifiering, hår-cell dissociation, möjliggör studier av både hår cellens bunt och soma. Hårcellerna dissocierades mekaniskt på ett objektglas för avbildning och elektrofysiologiska inspelning 30. Slutligen kan hårcellerna extruderas från epitel genom att följa ett liknande dissociation protokoll men utan mekanisk dissociation steg. Denna behandling resulterar i hårceller som gradvis extrudera ut av epitelet, vilket ger basolateral åtkomst för elektrofysiologiska inspelningar samtidigt minimera mekaniska skador. Dessa preparat och deras många modifikationer demonstrerar mångsidigheten hos grodan säcken som ett modellsystem för den biofysiskastudie av sensoriska hörselceller.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |