Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

ل doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

الثقافة الجهاز كاملة من القرص الفقرية (IVD) يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، خلية الظواهر، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. نحن هنا وصف نظام الثقافة IVD باستخدام الماوس قطني وIVDs الذيلية في وحدات العمود الفقري وظيفية، والعديد من التطبيقات التي تستخدم هذا النظام.

Abstract

الفقرية القرص (IVD) انحطاط هو مساهم كبير في آلام أسفل الظهر. وIVD هو مفصل ليفي غضروفي التي تعمل على نقل وتخفيف الأحمال في العمود الفقري. تتألف IVD من نواة اللبية-بروتيوغليكان الغني (NP) والكولاجين الغنية بالطوق تليف (AF) تقع في نهاية لوحات الغضروفية. جنبا إلى جنب مع فقرات المجاورة، وهيكل فقرات-IVD يشكل وحدة العمود الفقري وظيفية (الاتحاد السوفياتي السابق). هذه المجهرية تحتوي على أنواع الخلايا الفريدة فضلا عن مصفوفات خارج الخلية فريدة من نوعها. الثقافة الجهاز كاملة من الاتحاد السوفياتي السابق يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، الظواهر تمايز الخلايا، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. وهكذا، تقنيات زراعة الأعضاء هي مفيدة بشكل خاص للتحقيق في الآليات البيولوجية المعقدة للIVD. هنا، نحن تصف النهج الإنتاجية العالية لزراعة كله قطني FSUs الفأر الذي يوفر منصة مثالية لدراسة آليات المرض والعلاجات للIVD. وعلاوة على ذلك، نحن تصف الصورةتطبيقات everal التي تستخدم هذه الطريقة الثقافة الجهاز لإجراء مزيد من الدراسات بما في ذلك على النقيض محسنة التصوير microCT وعالية الدقة النمذجة عنصر محدود ثلاثي الأبعاد من IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

آلام أسفل الظهر (LBP) هو العامل الرئيسي للإعاقة العالمية وفقدان الإنتاجية في مكان العمل، وينفق الاميركيون وحدها ما يزيد على 50 مليار دولار على العلاج LBP 1. على الرغم من أن انتشارا، مسببات LBP لا تزال معقدة ومتعددة العوامل. ومع ذلك، القرص الفقرية (IVD) انحطاط هو من بين عوامل الخطر الأكثر أهمية ليرة لبنانية (2).

ويتكون من ثلاثة IVD المجهرية: والخارجي بالطوق تليف (AF)، ونواة اللبية الداخلية (NP)، واثنين من الصفائح الطرفية الغضروفية التي ساندويتش الهيكل كله قريب وبشكل أقصى 3. مع الشيخوخة وانحطاط، ومكونات IVD تتغير هيكليا، إنشائي، وميكانيكيا 4. وتشمل هذه التغييرات فقدان البروتيوغليكان والماء في NP، انخفض ارتفاع القرص، وتدهور الكفاءة الميكانيكية 5. هذه التعديلات هيكثيرا ما يكون مصحوبا السيتوكينات التي تعزز استجابة التهابية، وكذلك العدلة والجذر الظهري العقدة اقتحام الفضاء المشترك وبلغت ذروتها في سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى أعراض LBP 6.

دراسة آليات IVD انحطاط هو التحدي في البشر لأنه غالبا ما يكون من غير الممكن عزل سبب انحطاط قبل حدوث آلام أسفل الظهر. وهكذا، فإن المقاربة الاختزالية تبسيط النظام التجريبي وصولا الى الجهاز الخاص بالتحاليل المخبرية يسمح الآلية صقل المتغيرات السببية وفحص آثار المصب من 5. يتم تقليل النظام فقط سكان الخلية الأم والمحيطة المصفوفة خارج الخلية، مما يمكن تفسير مباشر للآثار مؤثرات الخارجية على انحطاط IVD. وعلاوة على ذلك، وانخفاض التكلفة وقابلية للنماذج الفئران، فضلا عن عدد كبير من الحيوانات المعدلة وراثيا تسمح رانه فحص المستهدفة السريع لآليات التنكسية IVD والعلاجات المحتملة. هنا، نحن تصف نظام الجهاز ثقافة الفئران التي تحفظ IVD الخلوية والأنسجة الاستقرار أكثر من 21 أيام، مع التركيز بشكل خاص نظرا لأنماط التماثل الساكن والميكانيكية والهيكلية، والتهابات في IVDs. باستخدام هذه الطريقة، ونحن نراقب التغيرات الوظيفية للIVDs 'في الناجمة عن طعنة نموذج إصابة 8 إلى فهم آليات وراء تنكس القرص. وعلاوة على ذلك، نحن تصف العديد من التطبيقات لهذا الأسلوب الثقافة الجهاز لإجراء مزيد من الدراسات بما في ذلك على النقيض محسنة التصوير microCT وثلاثي الأبعاد النمذجة عالية الدقة من IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لجامعة واشنطن في لجنة الدراسات الحيوانية لويس القديس.

1. الحيوانات

  1. الحصول على سلالتين من الفئران: 10 الاسبوع القديمة BALB / ج (ن = 6، BALB-M، BALB / cAnNTac) و 10 أسبوع القديمة العامل النووي كابا B-وسيفيراز الحيوانات مراسل (NF-κβ لوك) ولدت في BALB / ج الخلفية (ن = 6، BALB / ج-TG (ريلا لوك) 31Xen).
  2. قبل التشريح، والموت ببطء الحيوانات مع CO 2 جرعة زائدة بمعدل تدفق 2.5-3 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق تليها 2 دقيقة إضافية من المسكن الوقت.
  3. تطهير المنطقة الخارجية للحيوان قبل الاستحمام في حمام الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة قبل تشريح.

2. تشريح

  1. اجراء خفض طولية العمودي على السطح الظهري للفأرة باستخدام مقص تشريح الصغيرة لفضح تجويف الجسم.
  2. جعل اثنين من التخفيضات العمودية الطولية على جانبي العمود الفقري الحيوان بدءا منأول الفقرات القطنية (L1) إلى فقرات الذيل (C8).
  3. باستخدام مشرط، ملقط غرامة، ومقص تشريح غرامة، وإزالة بعناية العمود الفقري من L1-C8 من تجويف جسم الحيوان.
  4. إزالة بعناية الأنسجة الرخوة المحيطة الزائدة العمود الفقري، مع ضمان أن لا كشط أو تجرح IVD على الجانب البطني.
  5. وعلاوة على ذلك تشريح العمود الفقري في الفقرات القرص-فقرات العمود الفقري وحدات وظيفية (FSUs) في L1 / L2، L3 / L4، L5 / L6، C3 / C4، C5 / C6، وأقراص C7 / C8.
  6. شطف FSUs في محلول ملحي متوازن هانك تستكمل مع 1٪ البنسلين، الستربتوميسين لمدة 2 دقيقة.
  7. عشوائيا تعيين FSUs إلى ثلاث مجموعات: جاهل وغير المعالجة FSUs (الطازجة) ومثقف ولكن غير المعالجة FSUs (التحكم)، ومثقف وطعنة تعامل FSUs (الطعنة).
  8. التقط تجميد العينات الطازجة الاتحاد السوفياتي السابق مع النيتروجين السائل على الفور بعد تشريح وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية.

3. الجهاز الظروف الثقافة

  1. إعداد 500 مل من وسائط الثقافة العقيمة 1: 1 Dulbecco لتعديل النسر المتوسط: المغذيات خليط F12 (DMEM: F12) تستكمل مع المصل 20٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين.
  2. باستخدام 10 مل الماصات المصلية، ماصة 2 مل من وسائط الثقافة في كل بئر من لوحة الثقافة 24 أيضا.
  3. وبعد تشريح وشطف، وضع كل الاتحاد السوفياتي السابق في بئر الفردية في 24 لوحة جيدا مليئة سائل الإعلام.
  4. احتضان هذه العينات في حاضنة العقيمة التي تحافظ على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 20٪ O 2 و> 90٪ الرطوبة.
  5. بعد فترة ثقافة الأولية من 24 ساعة، ميكانيكيا تجرح عينات مجموعة الطعنة عبر ثقب إبرة من الحلقة الليفية باستخدام العقيمة إبرة 27 عيار كما هو مبين في الشكل 1A.
  6. تغيير وسائل الاعلام كل 48 ساعة عن طريق إعداد 24-جيدا لوحة جديدة ثقافة مليئة سائل الإعلام، وبنقل العينات من لوحة قديمة للاستخدام ملاقط معقمة جديدة. نضح في وسائل الإعلام القديمة وdispos (ه) من لوحة الثقافة القديمة في حاوية نفايات بيولوجية.
  7. في اليوم الأخير من الثقافة، واحتضان جميع العينات في وسائل الإعلام التي تحتوي على 0.75 ملغ / مل نيترو كلوريد نتروبلو الأزرق لمدة 24 ساعة.
  8. بعد ذلك، وتجميد جميع FSUs مع النيتروجين السائل وتخزينه في الثلاجة -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاختبار الميكانيكية أو الأنسجة (الشكل 1B).

4. القياسات الطولية NF كيلوبايت

  1. صورة FSUs من الحيوانات NF-κβ-وسيفيراز في 1 و 5 و 13 و 19 يوما لتقييم التعبير NF كيلوبايت.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل وسيفيرين إلى كل بئر واحتضان في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. صورة عينات للتلألؤ بيولوجي باستخدام نظام التصوير في زمن التعرض 1 دقيقة ووضع بن ل2.
  4. وفي الوقت نفسه، استخدام الجهاز لالتقاط صورة وتراكب مع الصورة تلألؤ بيولوجي لتحديد الموقع التشريحي من التألق في IVD.

الطبقة = "jove_title"> 5. تقييم الميكانيكية

  1. تحديد السلوك الميكانيكي للIVDs باستخدام التي تسيطر عليها النزوح ضغط ديناميكي 9.
  2. باستخدام تشريح المجهر، مشرط، وملاقط، وإزالة الهيئات الفقري العظمية من الاتحاد السوفياتي السابق من كل عينة مع الحفاظ على الصفائح الطرفية الغضروفية سليمة والمرفقة إلى IVD.
  3. إرفاق IVDs معزولة لوحة الألومنيوم 1 سم × 1 سم × 0.2 سم باستخدام غراء سريع الغراء.
  4. قياس ارتفاع القرص وعرض عن طريق اتخاذ ما معدله ثلاثة قياسات على المحور الطولي للكل قرص باستخدام ميكرومتر ليزر. حساب نسبة ارتفاع القرص بقسمة متوسط ​​ارتفاع القرص أقصى عرض القرص.
  5. استخدام ارتفاع القرص قياس لحساب القيم سلالة المدخلات المستخدمة في الاختبار الميكانيكي. لاحظ أن متوسط ​​ارتفاع القرص كان ما يقرب من 690 ميكرون ± 39 ميكرون.
  6. وضع العينات في الفوسفات حمام ملحي تحت compressiعلى الجهاز وتحميلها مسبقا على القرص إلى 0.02 N.
  7. دوريا ضغط القرص باستخدام الموجي الجيبية في 1 هرتز لمدة 20 دورات على مستوى سلالة 1٪ ومستوى سلالة 5٪ لمدة 3 محاكمات كل وتسجيل القيم الحمل وتهجير IVD. سماح 10 دقيقة من وقت الراحة بين التجارب للقرص للاسترخاء ولمنع الإصابة.
  8. حساب متوسط ​​صلابة من مرحلة التحميل من الدورة الماضية، وحساب الخسارة الظل من زاوية الطور بين تحميل البيانات والتشريد.

6. بروتيوغليكان والكولاجين الكمي

  1. وبعد الاختبار الميكانيكي، وقياس الوزن الرطب القرص عن طريق وضع IVD معزولة في أنبوب الطرد المركزي قبل tared وقياس الوزن باستخدام الميزان التحليلي.
  2. هضم IVDs معزولة في 250 ميكرولتر حل الهضم غراء (0.1 M خلات الصوديوم، 0.01 M EDTA، 0.005 M السيستين حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.4) بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية باستخدام سخان كتلة.
  3. عينات الطرد المركزي لمدة 10 دقيقةفي 2000 x ج وجمع السائل طاف.
  4. قياس محتوى بروتيوغليكان من IVD باستخدام الأزرق (DMMB) فحص dimethylmethylene مع المعايير شوندروتن كبريتات.
  5. يعد حل DMMB (DMMB 21 ملغ، 5 مل ايثانول المطلق، 2 غرام فورمات الصوديوم في 1 L ده 2 O).
  6. ماصة 30 ميكرولتر من المعايير والعينات في ثلاث نسخ في لوحة 96-جيدا، جنبا إلى جنب مع 250 ميكرولتر من محلول DMMB في كل بئر.
  7. قراءة الامتصاصية من لوحة في 525 نانومتر باستخدام مطياف.
  8. قياس محتوى الكولاجين باستخدام طقم فحص الهيدروكسي برولين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. علم الأنسجة

  1. إصلاح مجموعة فرعية من العينات في 4٪ امتصاص العرق لمدة 24 ساعة، وإزالة كلس في حمض الفورميك 5٪ لمدة 48 ساعة، ويذوى مع الإيثانول، وتضمينها في البارافين.
  2. باستخدام مبضع للفحص المجهري، قسم العينات sagittally في 10 ميكرون سمك وتطبيق المقاطع على الشرائح الزجاجية. وصمة عار على المقاطع باستخدام سفرانين-O / سريع غرامالتابعين ودابي.
  3. باستخدام المجهر الضوئي، الشرائح صورة في 10X التكبير.

8. على النقيض محسنة microComputed التصوير المقطعي (microCT)

  1. مسح مجموعة فرعية من العينات في نقطة زمنية 0، 2، 5، و 7 أيام باستخدام طولية Ioversol التباين تعزيز 10، ومحطة حمض الفسفومولبديك (PMA) التباين تعزيز في نقطة زمنية 7 أيام.
  2. 4 ساعات قبل microCT وقت الفحص، إضافة 300 ميكرولتر من 350 ملغ / مل اليود Ioversol حل للثقافة وسائل الإعلام لتركيز النهائي من ما يقرب من 50 ملغ / مل تحتوي على اليود حل Ioversol واحتضان في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ح.
  3. وبعد الحضانة، والتفاف العينة في شاش معقم ووضعه في أنبوب microcentrifuge 1 مل.
  4. مكان العينات في نظام microCT والمسح الضوئي في 45 keVp، 177 أمبير، 10.5 ميكرون حجم فوكسل، و 300 مللي التكامل.
  5. تصدير البيانات من microCT كملفات DICOM وتصور باستخدام برنامج (
  6. في نقطة زمنية لمدة 7 أيام، وتحديد العينات باستخدام محلول بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 24 ساعة، تليها 5٪ حل سلطة النقد الفلسطينية لمدة 3 أيام، والمسح الضوئي باستخدام نفس الإعدادات التي استخدمت في الخطوة 8.4.

9. ثلاثي الأبعاد النمذجة عنصر محدود

  1. قطعة ملفات DICOM من IVDs باستخدام برنامج مع العتبة اليدوية (على سبيل المثال، سيريكس).
  2. تحويل كميات NP وAF من IVD إلى تنسجم العناصر المحدودة القائم على فوكسل باستخدام Meshlab.
  3. الجمع بين المجهرية من NP وAF لتشكيل IVD كاملة وتطبيق شروط الحدود تجريبيا في برنامج العناصر المحددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الأرقام 2-3 تظهر نتائج ممثل التوزيع بروتيوغليكان، والتعبير NF كيلوبايت، وصلابة، اللزوجة، ارتفاع القرص، والوزن الرطب للIVDs الماوس مثقف. إذا مثقف بشكل صحيح، يجب المعلمات IVD من السيطرة على المجموعة لن تكون مختلفة كثيرا عن مجموعة جديدة. في حالة إصابة ثقافة أو خلاف ذلك شبهة، فإن مجموعة مراقبة يكون مختلفا عن مجموعة جديدة، وخاصة في التعبير NF كيلوبايت وتوزيع بروتيوغليكان (النتائج غير معروضة). أرقام 4-5 تطبيقات إظهار الثقافة الجهاز لاستخدام microCT على النقيض محسنة للحصول على نموذج ثلاثي الأبعاد للIVD. علاوة على ذلك، يمكن تطبيق النمذجة عنصر محدود لهذه الهياكل لتحديد الإجهاد والتوتر الأنسجة توزيعات بسبب السلوك الميكانيكي العالمي.

شكل 1
الشكل 1. التجريبيةنظرة عامة. تم تشريح (A) القرص الفقرية وحدة العمود الفقري وظيفية (FSUs) من الفقرات القطنية وقطاعات الذيلية. وFSUs الواردة فقرتين سليمة، والصفائح الطرفية الغضروفية، والقرص الفقرية. (B) وبعد تشريح، تم تقسيم العينات في مجموعات العلاج ومثقف في المختبر لمدة 21 يوما. بعد ذلك، تم استخدام مجموعة فرعية من عينات للفحص الميكانيكي وفحوصات الكيمياء الحيوية، في حين تم استخدام فرعية أخرى من العينات للتحليل النسيجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 1
الشكل 2. الأنسجة والتعبير NF كيلوبايت. (A) بعد 21 يوما في الثقافة، سفرانين O تلطيخ (الأحمر) يدل على أن يتم الحفاظ على المحتوى بروتيوغليكانفي كل من AF وNP في عينات التحكم. (B) العينات طعنة (الموقع ثقب المشار إليها بواسطة السهم) أظهرت انخفض محتوى بروتيوغليكان في كل من AF وNP. (C) نتروبلو تلطيخ الأزرق (الأزرق) يظهر شارك في الترجمة. (D) دابي تلطيخ يدل على أن الخلايا هي عملية الأيض نشطة وقابلة للحياة بعد 21 يوما في الثقافة الجهاز. (E) NF كيلوبايت التعبير في كل من عينات مراقبة والطعنة يشير أيضا إلى أن IVD غير قابلة للحياة وتستجيب لبيئتها. وزادت العينات طعنة التعبير NF كيلوبايت في 1 و 5 و 13، ونقاط الوقت 19 يوما. وتظهر IVDs القطني هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 1
الرقم 3. ميكانيكا وتكوينها. ( B) اختبار الميكانيكية أظهر أنه في 1٪ و 5٪ من مستويات الإجهاد، طعنة عينة صلابة وفقدان القيم المماس أقل نسبة إلى السيطرة على العينات. (C - D) فحوصات الكيمياء الحيوية أظهرت أن إنشائي، كان عينات طعنة بروتيوغليكان الدنيا ومحتوى الكولاجين (تطبيع الرطب الوزن) نسبة إلى السيطرة على العينات. (E - F) هيكليا، كان عينات طعن انخفضت القرص نسبة الطول والوزن الرطب بالنسبة لعناصر التحكم. ميكانيكيا، إنشائي، وهيكليا، وكانت القيم الطازجة ومراقبة عينات لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 1
الرقم 4. تعزيز التباين microCT visualizatأيون. microCT على النقيض محسنة يمكن استخدامها لتصور IVD في ثلاثة أبعاد خلال الفترة الثقافة. وتظهر IVDs الذيلية هنا. والفرق ربط Ioversol إلى AF (أقل توهين) وNP (أعلى توهين) يسمح احد لتمييز AF من NP. على العكس من ذلك، سلطة النقد الفلسطينية ترتبط بشكل تفضيلي بقايا الكولاجين في AF (أعلى توهين)، والصفائح الطرفية، والحبل الظهري. وتصور الصور باستخدام اللون الأبيض بحيث يمثل توهين عالية والأصفر يمثل تخفيف المتوسط، ويمثل اللون الأحمر التوهين منخفضة. (A - E) عدد المشاهدات السهمي من IVD في أيام 0، 2، 5، و 7 مع Ioversol النقيض من ذلك، وعلى النقيض مع سلطة النقد الفلسطينية. (F - J) عدد المشاهدات عرضية من IVD في أيام 0، 2، 5، و 6 مع Ioversol النقيض من ذلك، وعلى النقيض مع سلطة النقد الفلسطينية. وتظهر IVDs الذيلية هنا. الرجاء انقر هنا لعرض لانسخة rger من هذا الرقم.

شكل 1
الشكل 5. النمذجة محدود عنصر (FEM) من هيكل IVD. تحليل فيم هو أداة رياضية قوية تسمح حساب الاستجابة مواد محلية لشروط الحدود أكبر. على سبيل المثال، (A) في NP يمكن أن تقدم بشكل منفصل عن (B) للAF، ولكل حجرة يمكن تعيين خصائص التأسيسية فريدة من نوعها. يظهر (C) والجمع بين هيكل IVD مع كل من AF وNP في 3D. عندما يتم تطبيق الأحمال المحورية إلى القرص على endplate متفوقة مع endplate أدنى من حافة ثابت، يمكننا تحديد التركيزات المحلية من الضغوط والتوترات. النقاط الصفراء والسهام السوداء تمثل حمولة العقدي يجري تطبيقها. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويحدد هذا البروتوكول ثقافة الجهاز من الاتحاد السوفياتي السابق الفئران مع التركيز على رصد التغيرات البيولوجية في IVD. نجاحها في الحفاظ على هذه الثقافات يتطلب تقنيات معقمة دقيقة. على وجه الخصوص، تشريح الخطوات 2،1-2،6 وثقافة الخطوات من 3،1-3،6 يحتاجون إلى رعاية خاصة لضمان الحفاظ على ظروف معقمة، ويجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات ويفضل أن يكون في غرفة معزولة الإجراء مع تدفق الهواء HEPA للحد من الملوثات. لأن عملية تشريح تسبب صدمة للأنسجة، مطلوب الفترة شروط مسبقة 24 ساعة في 3.5 لجميع الفئات العلاج بما في ذلك الضوابط. المقايسات الحيوية يمكن استخدامها لضمان عينات حية وغير ملوثة، وأيضا بمثابة تأكيد على أن يتم الحفاظ على التوازن الخلوية. ويمكن أيضا القراءات التلألؤ NF كيلوبايت أن تستخدم لطوليا مراقبة الاستجابة الالتهابية للFSUs مثقف. زيادة في NF كيلوبايت صريحةملوثة أيون خلال الثقافة يمكن أن تشير إلى FSUs أو تحت الضغط من إصابة 11، وبالتالي فإننا إدراجه هنا باعتبارها خطوة محتملة استكشاف الأخطاء وإصلاحها. وأخيرا، مقارنات مع مجموعة جديدة تكون بمثابة نقطة تفتيش إضافية لعينات مثقف تحكم في الأنسجة والأداء الميكانيكي. هذه التقنية الثقافة هي قابلة للعينات متعددة لكل لوحة، وفي تجربتنا، وتصل إلى 24 عينة على 24 لوحة جيدا يمكن بسهولة أن أنجزت. ومع ذلك، فإن مضاعفة العينات أيضا ينتشر من خطر انتقال التلوث وبالتالي، فمن المستحسن أن FSUs يكون مثقف على لوحات منفصلة خلال استكشاف الأخطاء وإصلاحها. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن هذا البروتوكول يوفر تعليمات لفترة ثقافة 21 يوما، ونفس الطريقة يمكن استخدامها لفترات الثقافة التي تكون أطول أو أقصر. FSUs تم تربيتها بنجاح من قبل المختبر لفترات ثقافة تتراوح ما بين 1 أسبوع إلى 5 أسابيع.

Lآيك جميع النماذج، نماذج الثقافة الجهاز في الفئران لها حدود، ولا سيما في قدرتها على التقاط ظروف التحميل من البشر. وهناك أيضا الفروق الدقيقة في الهندسة بين الفئران والبشر IVDs 12، والبشر هم ذو قدمين مع الأحمال المحورية في المقام الأول على العمود الفقري في حين الجرذان والفئران هي ذوات الأربع. ومع ذلك، منذ حالة مثقف يتم تفريغ نسبيا في شكله الحالي، من المرجح وضع التحميل لعدم أثرت على IVDs. أنظمة أخرى مثل نماذج الثقافة البقري IVD الجهاز 13 و 14 قد تكون أكثر ملاءمة للتفاعل الميكانيكية والتحميل. وعمل في المستقبل تتضمن ظروف التحميل لتمكين التحقيق في التفاعلات mechanobiological بين العوامل الميكانيكية والبيئية. قوة هذا النهج تكمن في تقريرها الاتساق، وبراعة، والقدرة على التصوير ذات الدقة العالية. يوضح نهجنا هنا أنه من الممكن للثقافة بقطني أوراسكوم تليكوم القابضة وIVDs الذيلية، ولكن من المهم أن نلاحظ أن هذه الأقراص هي مختلفة تشريحيا عبر الشيخوخة والتنمية 15. على هذا النحو، لدينا تصميم تجريبي يعشوئ الفقرات القطنية ومستويات الذيلية على حدة.

microCT على النقيض محسنة تسمح عالية الدقة، تدميري، والتصوير ثلاثي الأبعاد من IVD. عوامل التباين مختلفة يمكن استخدامها لتسليط الضوء على الجوانب التركيبية مختلفة من IVD. علينا أن نظهر هنا استخدام Ioversol، وغير السامة للخلايا وكيل ماء التي تحتوي على اليود 10، وحمض الفسفومولبديك (PMA)، وهو جزيء من المعادن الثقيلة التي يخلب إلى بقايا الكولاجين الأمينية. باستخدام هذه وكلاء النقيض من ذلك، الميزات المجهرية في IVD يمكن إبراز وتحديد. Ioversol يميز الماء النسبي للأنسجة IVD، وبالتالي توفير التناقض بين النواة اللبية الغنية بالمياه والحلقة الليفية أقل المائية.تقدم سلطة النقد الفلسطينية تمايز تكوين الكولاجين النسبي في الأنسجة وسيسلط الضوء على لوحات نهاية، الحلقة الليفية، والحبل الظهري. Ioversol يمكن استخدامها أثناء الثقافة لتحديد التغييرات طولية في الماء، في حين يمكن أن تطبق سلطة النقد الفلسطينية إلى IVD عند نقطة طرفية الثقافة لرصد التغيرات الكولاجين.

وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية الاستفادة سلالات أخرى من المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران لفهم جوانب مختلفة من انحطاط IVD في أمراض أخرى. وعلاوة على ذلك، بل هو منصة محتملة للثقافة مشتركة مع أجهزة الجسم الأخرى والخلايا مثل العقد الجذرية الظهرية لتحديد التفاعلات التي يمكن أن تسهم في الخاص بالتحاليل المخبرية انحطاط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن واضعي هذه المخطوطة أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مركز جامعة واشنطن العضلية الهيكلية البحوث (NIH P30 AR057235)، مركز التصوير الجزيئي (NIH P50 CA094056)، ميكانيكا الأحياء التدريب غرانت (NIH 5T32EB018266)، NIH R21AR069804، والمعاهد الوطنية للصحة K01AR069116. فإن الكتاب أود أن أشكر باتريك وونغ لإسهاماته في مجال جمع البيانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter