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Bioengineering

एक doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

intervertebral डिस्क (IVD) के पूरे अंग संस्कृति देशी बाह्य मैट्रिक्स, सेल समलक्षणियों, और सेलुलर-मैट्रिक्स बातचीत बरकरार रखता है। यहाँ हम माउस काठ का और उनके कार्यात्मक रीढ़ की इकाइयों में दुम IVDs और कई आवेदनों इस प्रणाली का उपयोग का उपयोग कर एक IVD संस्कृति प्रणाली का वर्णन।

Abstract

Intervertebral डिस्क (IVD) अध: पतन कम पीठ दर्द में महत्वपूर्ण योगदान है। IVD एक fibrocartilaginous संयुक्त कि संचारित और रीढ़ की हड्डी में भार गीला करने के लिए कार्य करता है। IVD एक proteoglycan युक्त नाभिक pulposus (एनपी) और एक कोलेजन युक्त वलय फाइब्रोसिस (वायुसेना) उपास्थि अंत प्लेटों द्वारा sandwiched के होते हैं। साथ में आसन्न कशेरुकाओं के साथ, कशेरुकाओं-IVD संरचना एक कार्यात्मक रीढ़ इकाई (FSU) रूपों। ये microstructures अद्वितीय प्रकार की कोशिकाओं के साथ-साथ अद्वितीय कोशिकी मैट्रिक्स होते हैं। FSU के पूरे अंग संस्कृति देशी बाह्य मैट्रिक्स, सेल भेदभाव समलक्षणियों, और सेलुलर-मैट्रिक्स बातचीत बरकरार रखता है। इस प्रकार, अंग कल्चर तकनीक IVD के जटिल जैविक तंत्र की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यहाँ, हम पूरे काठ का माउस FSUS कि IVD के लिए रोग तंत्र और चिकित्सा के अध्ययन के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है संवर्धन के लिए एक उच्च throughput दृष्टिकोण का वर्णन। इसके अलावा, हम रों का वर्णनeveral अनुप्रयोगों है कि इसके विपरीत-बढ़ाया microCT इमेजिंग और IVD के तीन आयामी उच्च संकल्प परिमित तत्व मॉडलिंग सहित आगे के अध्ययन का संचालन करने के इस अंग संस्कृति पद्धति का उपयोग।

Introduction

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कम पीठ दर्द (LBP) वैश्विक विकलांगता के लिए प्रमुख कारक और कार्यस्थल में उत्पादकता है, और अमेरिकियों अकेले LBP उपचार 1 पर 50 अरब डॉलर से अधिक खर्च करते हैं। हालांकि प्रचलित, LBP एटियलजि जटिल और बहुघटकीय बनी हुई है। हालांकि, intervertebral डिस्क (IVD) अध: पतन LBP 2 के लिए सबसे महत्वपूर्ण जोखिम वाले कारकों में से एक है।

IVD तीन microstructures से बना है: बाहरी वलय फाइब्रोसिस (वायुसेना), आंतरिक नाभिक pulposus (एनपी), और दो उपास्थि endplates कि पूरे संरचना proximally और distally 3 सैंडविच। उम्र बढ़ने और अध: पतन के साथ, IVD घटकों संरचनात्मक रूप से बदलने के लिए, संघटनात्मक, और यंत्रवत् 4। इन परिवर्तनों प्रोटियोग्लाइकन और एनपी में हाइड्रेशन की हानि शामिल हैं, डिस्क ऊंचाई में कमी आई, और यांत्रिक क्षमता 5 बिगड़ गया। ये परिवर्तन कर रहे हैंअक्सर साइटोकिन्स कि एक भड़काऊ प्रतिक्रिया है, साथ ही संयुक्त घटनाओं LBP लक्षण 6 के लिए नेतृत्व की एक झरना में समापन अंतरिक्ष में न्युट्रोफिल और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि घुसपैठ को बढ़ावा देने के साथ होगा।

IVD अध: पतन के तंत्र का अध्ययन मानव में चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह अक्सर कम पीठ दर्द की घटना से पहले अध: पतन का कारण अलग करना संभव नहीं है। इस प्रकार, IVD अंग के लिए नीचे प्रायोगिक प्रणाली को सरल बनाने का एक न्यूनकारी दृष्टिकोण कारण चर के यंत्रवत ठीक करने की अनुमति देता है और उनके नीचे की ओर प्रभाव 5 की जांच। प्रणाली केवल देशी सेल आबादी और बाह्य मैट्रिक्स आसपास करने के लिए कम है, इस प्रकार IVD अध: पतन पर बाहरी उत्तेजनाओं के प्रभाव का प्रत्यक्ष व्याख्या सक्षम करने से। इसके अलावा, कम लागत और murine मॉडल की क्षमता है, साथ ही आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों 7 की बड़ी संख्या, टी के लिए अनुमतिIVD अपक्षयी तंत्र और संभावित उपचारों के वह तेजी से लक्षित स्क्रीनिंग। यहाँ, हम जिसमें IVD सेलुलर और ऊतक स्थिरता IVDs ', समस्थिति यांत्रिक, संरचनात्मक, और भड़काऊ पैटर्न को दिया विशेष ध्यान देने के साथ, 21 दिनों में बनाए रखा है एक murine अंग संस्कृति प्रणाली का वर्णन। इस विधि का उपयोग करना, हम IVDs 'वार प्रेरित चोट 8 मॉडल में कार्यात्मक परिवर्तनों की निगरानी डिस्क अध: पतन के पीछे तंत्र को समझने के लिए। इसके अलावा, हम इस अंग संस्कृति विधि के कई अनुप्रयोगों विपरीत-बढ़ाया microCT इमेजिंग और IVD के तीन आयामी उच्च संकल्प मॉडलिंग सहित आगे के अध्ययन का संचालन करने का वर्णन।

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Protocol

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सभी पशु प्रयोगों सेंट लुइस पशु अध्ययन समिति में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया।

1. पशु

  1. चूहों के दो उपभेदों प्राप्त करें: 10-सप्ताह पुरानी BALB / ग (n = 6, BALB-एम / BALB cAnNTac) और 10 सप्ताह पुरानी परमाणु कारक कप्पा-B-luciferase संवाददाता जानवरों (NF-κβ ल्यूक) एक पर नस्ल BALB / ग पृष्ठभूमि (n = 6, BALB / ग-टीजी (रेला ल्यूक) 31Xen)।
  2. विच्छेदन करने से पहले, 5 मिनट के लिए 2.5-3 एल / मिनट की प्रवाह की दर समय में रहने वाली एक अतिरिक्त 2 मिनट के बाद में सीओ 2 की अधिक मात्रा के साथ जानवरों euthanize।
  3. विच्छेदन से पहले 2 मिनट के लिए एक 70% इथेनॉल स्नान में यह स्नान करके जानवर के बाहर क्षेत्र कीटाणुरहित।

2. विच्छेदन

  1. माउस छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग कर शरीर गुहा का पर्दाफाश करने की पृष्ठीय सतह पर एक अनुदैर्ध्य खड़ी कटौती करें।
  2. से शुरू जानवर की रीढ़ की हड्डी के दोनों तरफ दो अनुदैर्ध्य खड़ी कटौती करनेपहले काठ कशेरुकाओं (एल 1) दुम कशेरुकाओं को (सी 8)।
  3. एक छुरी, ठीक संदंश, और ठीक विच्छेदन कैंची का प्रयोग, ध्यान से जानवर के शरीर गुहा से एल 1-सी 8 से रीढ़ की हड्डी को हटा दें।
  4. ध्यान से, अतिरिक्त नरम मेरूदंड आसपास के ऊतकों को हटाने के स्क्रैप या उदर पक्ष पर IVD घायल नहीं करने के लिए सुनिश्चित करते हुए।
  5. इसके अलावा एल 1 / एल 2, एल 3 / L4, एल 5 / L6, सी 3 / सी 4, सी 5 / सी 6, और सी 7 / सी 8 डिस्क पर कशेरुकाओं-डिस्क-कशेरुकाओं कार्यात्मक रीढ़ की इकाइयों (FSUS) में मेरूदंड काटना।
  6. हांक संतुलित नमक समाधान 2 मिनट के लिए 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में FSUS रिंस करें।
  7. असभ्य और अनुपचारित FSUS (ताजा), सुसंस्कृत लेकिन अनुपचारित FSUS (नियंत्रण), और सुसंस्कृत और चाकू का इलाज किया FSUS (वार): बेतरतीब ढंग से तीन समूहों में FSUS आवंटित।
  8. स्नैप तुरंत विच्छेदन और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में दुकान के बाद तरल नाइट्रोजन के साथ ताजा FSU नमूने फ्रीज।

3. अंग संस्कृति शर्तें

  1. की बाँझ संस्कृति मीडिया के 500 एमएल तैयार करें 1: 1 Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम: पोषक तत्व मिश्रण F12 (DMEM: F12) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
  2. एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में से प्रत्येक कुएं में 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipettes, पिपेट संस्कृति मीडिया के 2 एमएल का उपयोग करना।
  3. विच्छेदन के बाद और कुल्ला, मीडिया से भरे 24-अच्छी तरह से थाली में एक व्यक्ति कुएं में प्रत्येक FSU जगह।
  4. एक बाँझ इनक्यूबेटर कि 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 20% हे 2 और> 90% नमी को बनाए रखता है में नमूने सेते हैं।
  5. 24 घंटे की एक प्रारंभिक संस्कृति अवधि के बाद, यंत्रवत् के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया है एक बाँझ 27 गेज सुई का उपयोग तंतु वलय की सुई पंचर के माध्यम से वार समूह नमूने घायल।
  6. एक नया मीडिया से भरे 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट की तैयारी द्वारा मीडिया बदलें हर 48 घंटे, और नए बाँझ चिमटी का उपयोग करने के पुराने थाली से स्थानांतरण के नमूने हैं। पुराने मीडिया और dispos Aspirateएक biohazard कचरे के डिब्बे में पुराने संस्कृति थाली के ई।
  7. संस्कृति के अंतिम दिन, 24 घंटे के लिए 0.75 मिलीग्राम / एमएल नाइट्रो नीले tetrazolium क्लोराइड युक्त मीडिया में सभी नमूनों को सेते हैं।
  8. बाद में, फ्रीज सभी FSUS यांत्रिक परीक्षण या ऊतक विज्ञान (चित्रा 1 बी) के लिए तैयार है जब तक तरल नाइट्रोजन और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर के साथ।

4. अनुदैर्ध्य माप NF-κB

  1. छवि 1 पर NF-κβ-luciferase जानवरों से FSUS, 5, 13, और 19 दिनों NF-κB अभिव्यक्ति का आकलन करने के।
  2. 1 मिलीग्राम / एमएल luciferin समाधान के 10 μL प्रत्येक के लिए 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से जोड़ें और सेते हैं।
  3. छवि bioluminescence के लिए नमूने एक 1 मिनट जोखिम समय और 2 के बिन सेटिंग के साथ इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर।
  4. समवर्ती, मशीन का उपयोग एक तस्वीर लेने के लिए और bioluminescence छवि के साथ ओवरले IVD में चमक के संरचनात्मक स्थान निर्धारित करने के लिए।
  1. विस्थापन नियंत्रित गतिशील संपीड़न 9 का उपयोग करके IVDs के यांत्रिक व्यवहार का निर्धारण।
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप, छुरी, और चिमटी का प्रयोग, उपास्थि endplates बरकरार है और IVD से जुड़ी रखते हुए प्रत्येक नमूने से FSU की हड्डी कशेरुका निकायों को हटा दें।
  3. एक 1 सेमी एक्स 1 सेमी x 0.2 सेमी एल्यूमीनियम cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर थाली में अलग IVDs देते हैं।
  4. एक लेजर माइक्रोमीटर का उपयोग कर प्रत्येक डिस्क के अनुदैर्ध्य अक्ष पर तीन माप के एक औसत लेने के द्वारा डिस्क ऊंचाई और चौड़ाई का आकलन करें। अधिकतम डिस्क चौड़ाई से औसत डिस्क ऊंचाई विभाजित करके डिस्क ऊंचाई अनुपात की गणना।
  5. यांत्रिक परीक्षण में प्रयुक्त इनपुट तनाव मूल्यों की गणना करने मापा डिस्क ऊंचाई का उपयोग करें। ध्यान दें कि औसत डिस्क ऊंचाई लगभग 690 सुक्ष्ममापी ± 39 सुक्ष्ममापी था।
  6. एक फॉस्फेट बफ़र खारा स्नान में नमूने compressi अंतर्गत रखेंमशीन पर और 0.02 एन करने के लिए डिस्क प्रीलोड
  7. Cyclically डिस्क एक sinusoidal तरंग का उपयोग कर प्रत्येक 3 परीक्षण के लिए 1% तनाव के स्तर पर 20 चक्र और 5% तनाव के स्तर के लिए 1 हर्ट्ज पर सेक और IVD का लोड और विस्थापन मूल्यों रिकॉर्ड है। आराम करने के लिए और चोट को रोकने के डिस्क के लिए परीक्षण के बीच समय आराम कर के 10 मिनट की अनुमति दें।
  8. पिछले चक्र की लोडिंग चरण से औसत कठोरता की गणना करें, और लोड और विस्थापन डेटा के बीच चरण कोण से नुकसान स्पर्शज्या की गणना।

6. proteoglycan और कोलेजन मात्रा

  1. यांत्रिक परीक्षण के बाद, एक पूर्व tared अपकेंद्रित्र ट्यूब में पृथक IVD रखने और एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर वजन को मापने के द्वारा डिस्क गीला वजन को मापने के।
  2. 250 μL में पृथक IVDs डाइजेस्ट papain पाचन समाधान (0.1 एम सोडियम एसीटेट, 0.01 एम EDTA, 0.005 एम सिस्टीन एचसीएल, पीएच 6.4) 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक ब्लॉक हीटर का उपयोग कर।
  3. 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नमूने2,000 XG पर और सतह पर तैरनेवाला तरल पदार्थ इकट्ठा।
  4. dimethylmethylene नीला (DMMB) chondroitin सल्फेट मानकों के साथ परख का उपयोग करके IVD की proteoglycan सामग्री का आकलन करें।
  5. DMMB समाधान (21 मिलीग्राम DMMB, 5 एमएल पूर्ण इथेनॉल, 1 एल DDH 2 हे में 2 जी सोडियम वह स्वरूप) तैयार करें।
  6. पिपेट एक 96 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों में मानकों की 30 μL और नमूने, प्रत्येक में DMMB समाधान के 250 μL अच्छी तरह के साथ।
  7. 525 एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर एनएम पर थाली के अवशोषण पढ़ें।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन परख किट का उपयोग कोलेजन सामग्री का आकलन करें।

7. प्रोटोकॉल

  1. 24 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में नमूने के एक सबसेट को ठीक करें, 48 घंटे के लिए 5% फार्मिक एसिड में de-कड़ा हो जाना, इथेनॉल के साथ निर्जलीकरण, और तेल में एम्बेड।
  2. sagittally 10 सुक्ष्ममापी मोटाई में एक सूक्ष्म नमूने का उपयोग करना, खंड और कांच स्लाइड पर वर्गों लागू होते हैं। सैफरैनीन-ओ / फास्ट जीआर का उपयोग कर वर्गों दागeen और DAPI।
  3. एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, छवि 10X आवर्धन पर स्लाइड।

8. कंट्रास्ट एनहांस्ड microComputed टोमोग्राफी (microCT)

  1. 0, 2, 5, और 7 दिन की समय 7 दिन के समय बिंदु पर अनुदैर्ध्य Ioversol विपरीत-वृद्धि 10, और टर्मिनल phosphomolybdic एसिड (पीएमए) विपरीत-वृद्धि का उपयोग कर बिंदुओं पर नमूने के एक सबसेट स्कैन करें।
  2. 4 घंटे microCT स्कैन समय से पहले, 4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 350 मिलीग्राम / लगभग 50 मिलीग्राम / एमएल आयोडीन युक्त Ioversol समाधान की एक अंतिम एकाग्रता के लिए संस्कृति मीडिया के लिए एमएल आयोडीन Ioversol समाधान के 300 μL जोड़ें और एक बाँझ इनक्यूबेटर में सेते एच।
  3. ऊष्मायन के बाद, एक 1 एमएल microcentrifuge ट्यूब में बाँझ जाली और जगह में नमूना लपेट दें।
  4. microCT प्रणाली में रखें नमूने और 45 keVp, 177 μA, 10.5 सुक्ष्ममापी वॉक्सेल आकार, और 300 एमएस एकीकरण पर स्कैन।
  5. DICOM फ़ाइलों के रूप में microCT से डेटा निर्यात और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कल्पना (
  6. 7 दिन की समय बिंदु पर, 24 घंटे के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान, 3 दिनों के लिए 5% पीएमए समाधान के बाद का उपयोग कर नमूने ठीक करें, और कदम 8.4 में उपयोग की जाती ही सेटिंग का उपयोग कर स्कैन।

9. तीन आयामी सीमित तत्व मॉडलिंग

  1. सेगमेंट के मैनुअल थ्रेशोल्डिंग (जैसे, OsiriX) के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर IVDs की DICOM फ़ाइलों।
  2. वॉक्सेल आधारित परिमित तत्व Meshlab का उपयोग कर meshes में IVD के एन पी और वायुसेना की मात्रा बदलें।
  3. एनपी और वायुसेना की microstructures कम्बाइन एक पूरा IVD फार्म और परिमित तत्व सॉफ्टवेयर में प्रयोगात्मक निर्धारित सीमा की स्थिति लागू करने के लिए।

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Representative Results

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आंकड़े 2-3 proteoglycan वितरण, NF-κB अभिव्यक्ति, कठोरता, चिपचिपाहट, डिस्क ऊंचाई, और गीला वजन सुसंस्कृत माउस IVDs के लिए के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। अगर ठीक से संवर्धित किया, नियंत्रण समूह के IVD मानकों ताजा समूह से काफी अलग नहीं होना चाहिए। (परिणाम नहीं दिखाया गया है) संस्कृति या संक्रमित अन्यथा समझौता किया है, तो नियंत्रण समूह ताजा समूह से अलग होगा, विशेष रूप से NF-κB अभिव्यक्ति और proteoglycan वितरण में। IVD की एक तीन आयामी मॉडल प्राप्त करने के लिए इसके विपरीत-बढ़ाया microCT का उपयोग करने के अंग संस्कृति के 4-5 शो अनुप्रयोगों आंकड़े; आगे, परिमित तत्व मॉडलिंग वैश्विक यांत्रिक व्यवहार की वजह से इन संरचनाओं ऊतक तनाव और तनाव वितरण निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता।

आकृति 1
चित्र 1 प्रायोगिकअवलोकन। (ए) intervertebral डिस्क कार्यात्मक रीढ़ की इकाइयों (FSUS) कमर और दुम क्षेत्रों से विच्छेदित कर रहे थे; FSUS दो बरकरार कशेरुकाओं, उपास्थि endplates, और intervertebral डिस्क निहित। (बी) के विच्छेदन के बाद, नमूने 21 दिनों के लिए इन विट्रो में उपचार समूहों में विभाजित किया और सुसंस्कृत थे। बाद में, नमूने के एक सबसेट, यांत्रिक परीक्षण और जैव रासायनिक assays के लिए इस्तेमाल किया, जबकि नमूनों की एक और सबसेट ऊतकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 2. प्रोटोकॉल और NF-κB अभिव्यक्ति। (ए) संस्कृति में 21 दिनों के बाद, सैफरैनीन हे धुंधला (लाल) दिखाती है proteoglycan सामग्री से बनाए रखा हैदोनों वायुसेना और एनपी नियंत्रण नमूनों में में। (बी) के वार नमूने (पंचर साइट तीर द्वारा इंगित) दोनों वायुसेना और एनपी में proteoglycan सामग्री में कमी आई दिखाया। (सी) tetrazolium नीले धुंधला (नीला) से पता चलता सह स्थानीयकरण। (डी) DAPI धुंधला पता चलता है कि कोशिकाओं पाचन सक्रिय और अंग संस्कृति में 21 दिन बाद व्यवहार्य हैं। दोनों नियंत्रण और वार नमूनों में (ई) NF-κB अभिव्यक्ति भी संकेत मिलता है कि IVD व्यवहार्य और अपने पर्यावरण के लिए उत्तरदायी है। वार नमूने 1, 5, 13 में NF-κB अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है, और 19 दिन की समय अंक। काठ का IVDs यहां दिए गए हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
3. यांत्रिकी और रचना चित्र। ( बी) यांत्रिक परीक्षण से पता चला कि 1% और 5% तनाव के स्तर पर, वार नमूना कठोरता और नुकसान स्पर्शरेखा मूल्यों के नमूने नियंत्रित करने के लिए कम सापेक्ष हैं। (सी - डी) बायोकेमिकल assays से पता चला कि संघटनात्मक, वार नमूने कम proteoglycan और कोलेजन सामग्री रिश्तेदार नमूने नियंत्रित करने के लिए (गीले वजन सामान्य) था। (ई - एफ) संरचनात्मक रूप से, वार नमूने एक कम डिस्क ऊंचाई अनुपात और नियंत्रण करने के लिए गीला वजन रिश्तेदार था। यंत्रवत्, संघटनात्मक, और संरचना की दृष्टि से, ताजा और नियंत्रण के नमूने मूल्यों नहीं एक दूसरे से काफी अलग थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 4. कंट्रास्ट एनहांस्ड microCT visualizatआयन। इसके विपरीत-बढ़ाया microCT संस्कृति की अवधि के दौरान तीन आयामों में IVD कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। दुम IVDs यहां दिए गए हैं। अंतर Ioversol वायुसेना के लिए (कम क्षीणन) और एनपी (उच्च क्षीणन) के बंधन एक एनपी से वायुसेना भेद करने के लिए अनुमति देता है। इसके विपरीत, पीएमए को प्राथमिकता वायुसेना (उच्च क्षीणन), endplates, और पृष्ठदंड में कोलेजन अवशेषों को बांधता है। छवियों रंग ऐसा है कि सफेद उच्च क्षीणन का प्रतिनिधित्व करता है, पीले मध्यम क्षीणन का प्रतिनिधित्व करता है का उपयोग करते हुए देखे गए थे, और लाल कम क्षीणन प्रतिनिधित्व करता है। (ए - ई) दिन 0, 2, 5 पर IVD, और 7 Ioversol विपरीत के साथ के बाण के विचारों, और पीएमए विपरीत के साथ। (एफ - जे) दिनों 0, 2, 5 पर IVD की अनुप्रस्थ विचारों, और Ioversol विपरीत के साथ 6, और पीएमए विपरीत के साथ। दुम IVDs यहां दिए गए हैं। एक ला देखने के लिए यहां क्लिक करेंइन आंकड़ों की rger संस्करण।

आकृति 1
चित्रा 5. परिमित तत्व मॉडलिंग (एफईएम) IVD संरचना की। एफईएम विश्लेषण एक शक्तिशाली गणितीय उपकरण है कि बड़े सीमा की स्थिति के लिए स्थानीय सामग्री प्रतिक्रिया की गणना की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, (ए) एनपी से (बी) वायुसेना अलग से प्रदान की जा सकती है, और प्रत्येक डिब्बे अद्वितीय संघटित गुण सौंपा जा सकता है। (सी) दोनों वायुसेना और एनपी के साथ एक संयुक्त IVD संरचना 3 डी में दिखाया गया है। अक्षीय भार है अवर endplate के साथ बेहतर endplate पर डिस्क को लागू किए जाने पर एक निश्चित बढ़त, हम तनाव और दबाव के स्थानीय सांद्रता निर्धारित कर सकते हैं। पीले डॉट्स और काले तीर एक नोडल लोड लागू किया जा रहा प्रतिनिधित्व करते हैं। एक देखने के लिए यहां क्लिक करेंइन आंकड़ों की बड़ा संस्करण।

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Discussion

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यह प्रोटोकॉल IVD में जैविक परिवर्तन की निगरानी पर जोर देने के साथ murine FSU का एक अंग संस्कृति की रूपरेखा। इन संस्कृतियों के सफल रखरखाव सावधान बाँझ तकनीक की आवश्यकता है। विशेष रूप से, विच्छेदन 2.1-2.6 कदम और संस्कृति कदम 3.1-3.6 सुनिश्चित करने के लिए बाँझ स्थिति बनाए रखा जाता है विशेष देखभाल की आवश्यकता है, और इन चरणों का एक HEPA हवा का प्रवाह दूषित पदार्थों को कम करने के लिए के साथ एक अलग प्रक्रिया कमरे में अधिमानतः किया जाना चाहिए। क्योंकि विच्छेदन प्रक्रिया के ऊतकों को आघात का कारण बनता है, 3.5 में 24 घंटे शर्त अवधि नियंत्रण सहित सभी उपचार समूहों के लिए आवश्यक है। व्यवहार्यता assays सुनिश्चित करने के लिए नमूने जीवित है और पवित्र हैं, और भी इसकी पुष्टि है कि सेलुलर homeostasis बनाए रखा है के रूप में काम किया जा सकता है। NF-κB चमक रीडिंग भी सुसंस्कृत FSUS की सूजन की प्रतिक्रिया पर नजर रखने के अनुदैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; NF-κB एक्सप्रेस में वृद्धिसंस्कृति FSUS का संकेत हो सकता दौरान आयन दूषित कर रहे हैं या नहीं तो 11 के संक्रमण से तनाव में है, और हम इस तरह यह यहाँ एक संभव समस्या निवारण चरण के रूप में शामिल हैं। अंत में, ताजा समूहों की तुलना ऊतक विज्ञान और यांत्रिक प्रदर्शन में नियंत्रण सुसंस्कृत नमूने के लिए एक अतिरिक्त जांच बिंदु के रूप में सेवा करते हैं। इस संस्कृति तकनीक प्रति प्लेट कई नमूने के लिए उत्तरदायी है, और हमारे अनुभव में, एक 24 अच्छी तरह से थाली पर अप करने के लिए 24 नमूने आसानी से पूरा किया जा सकता। हालांकि, नमूनों की बहुसंकेतन भी पार संदूषण का जोखिम से प्रसारित और इस प्रकार, यह अनुशंसित है कि FSUS समस्या निवारण के दौरान अलग प्लेटों पर संवर्धित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जबकि इस प्रोटोकॉल 21 दिन की संस्कृति की अवधि के लिए निर्देश प्रदान करता है, एक ही विधि संस्कृति अवधि कि कम या अधिक कर रहे हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। FSUS सफलतापूर्वक संस्कृति 1 सप्ताह से 5 हफ्तों से लेकर अवधि के लिए हमारे प्रयोगशाला द्वारा संवर्धित किया गया है।

एलसभी मॉडलों आइक, murine में अंग संस्कृति मॉडल विशेष रूप से मनुष्य की लोडिंग की स्थिति पर कब्जा करने की क्षमता में, सीमाएं हैं। वहाँ भी murine और मानव IVDs 12 के बीच ज्यामिति में सूक्ष्म अंतर, और मनुष्यों रीढ़ की हड्डी पर मुख्य रूप से अक्षीय लोड के साथ द्विपाद रहे हैं, जबकि चूहों और चूहों quadrupeds हैं। हालांकि, बाद से सुसंस्कृत हालत अपेक्षाकृत अपने मौजूदा रूप में उतार दिया जाता है, लोड हो रहा है मोड संभावना IVDs को प्रभावित किया है नहीं है। ऐसे गोजातीय IVD अंग संस्कृति मॉडल के रूप में अन्य प्रणालियों 13, 14 बेहतर यांत्रिक और लोड हो रहा है बातचीत के लिए अनुकूल हो सकता है। भविष्य काम यांत्रिक और पर्यावरणीय कारकों के बीच mechanobiological बातचीत की जांच सक्षम करने के लिए लोड हो रहा है की स्थिति को शामिल करेगा। इस दृष्टिकोण की शक्ति इसकी निरंतरता, बहुमुखी प्रतिभा, और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए क्षमता में निहित है। हमारे यहाँ दृष्टिकोण को दर्शाता है कि यह संस्कृति ख के लिए संभव हैअन्य संगठनों के कमर और दुम IVDs, लेकिन यह ध्यान रखें कि इन डिस्क उम्र बढ़ने और विकास 15 के पार संरचनात्मक रूप से अलग हैं महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, हमारी प्रयोगात्मक डिजाइन काठ और अलग से दुम स्तरों randomizes।

इसके विपरीत-बढ़ाया microCT उच्च संकल्प, nondestructive, IVD के तीन आयामी इमेजिंग अनुमति देते हैं। विभिन्न विपरीत एजेंटों IVD के विभिन्न compositional पहलुओं को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम यहाँ Ioversol, एक आयोडीन युक्त गैर साइटोटोक्सिक हाइड्रोफिलिक एजेंट 10, और phosphomolybdic एसिड (पीएमए), एक भारी धातु अणु है कि कोलेजन अमीनो अवशेषों को chelates के प्रयोग का प्रदर्शन। इन विपरीत-एजेंटों का उपयोग करना, IVD में microstructural सुविधाओं पर प्रकाश डाला और पहचाना जा सकता है। Ioversol IVD ऊतकों के रिश्तेदार जलयोजन अलग करता है, जिससे पानी युक्त नाभिक pulposus और कम से हाइड्रेटेड तंतु वलय के बीच विरोधाभास प्रदान करते हैं।पीएमए ऊतकों में रिश्तेदार कोलेजन संरचना के भेदभाव को प्रदान करता है और अंत प्लेटें, तंतु वलय, और पृष्ठदंड पर प्रकाश डाला जाएगा। Ioversol, जलयोजन में अनुदैर्ध्य परिवर्तन निर्धारित करने के लिए संस्कृति के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता पीएमए कोलेजन परिवर्तन की निगरानी के लिए संस्कृति के टर्मिनल बिंदु पर IVD के लिए लागू किया जा सकता है।

इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों ट्रांसजेनिक और नॉकआउट चूहों के अन्य उपभेदों का उपयोग अन्य बीमारियों में IVD अध: पतन के विभिन्न पहलुओं को समझने के लिए शामिल हैं। इसके अलावा, यह अन्य अंग प्रणालियों और इस तरह के पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया के रूप में कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति बातचीत कि अध: पतन IVD में योगदान कर सकते की पहचान करने के लिए एक संभावित मंच है।

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Disclosures

इस पांडुलिपि के लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

इस काम के वाशिंगटन विश्वविद्यालय पेशीकंकालीय रिसर्च सेंटर (एनआईएच P30 AR057235), आण्विक इमेजिंग सेंटर (एनआईएच P50 CA094056), mechanobiology प्रशिक्षण अनुदान (एनआईएच 5T32EB018266), एनआईएच R21AR069804, और एनआईएच K01AR069116 द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों डेटा संग्रह में उनके योगदान के लिए पैट्रिक वोंग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

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References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; अंग संस्कृति म्यूरीन intervertebral डिस्क के मॉडल
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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