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Bioengineering

Un doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.

Abstract

Disco intervertebrale (IVD) la degenerazione è un contributo significativo per il mal di schiena. L'IVD è una joint fibrocartilaginea che serve per trasmettere e smorzare i carichi nella colonna vertebrale. IVD consiste in un polposo ricco di proteoglicani nucleo (NP) e un ricco di collagene annulus fibrosi (AF) a sandwich da cartilaginee piastre terminali. Unitamente alle vertebre adiacenti, la struttura vertebre-IVD formano un'unità funzionale spina (FSU). Questi microstrutture contengono tipi di cellule uniche e matrici extracellulari unici. cultura organo intero FSU conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi differenziazione cellulare, e le interazioni cellulari-matrice. Pertanto, le tecniche di coltura organo sono particolarmente utili per studiare i complessi meccanismi biologici della IVD. Qui, descriviamo un approccio high-throughput per la coltura di tutta la FSU del mouse lombare che fornisce una piattaforma ideale per lo studio dei meccanismi di malattia e le terapie per l'IVD. Inoltre, descriviamo sapplicazioni everal che utilizzano questo metodo di coltura organo di condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione elementi finiti modellizzazione della IVD.

Introduction

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Lombalgia (LBP) è il fattore principale per la disabilità globale e la perdita di produttività sul posto di lavoro, e gli americani spendono solo al di sopra di 50 miliardi di dollari sul trattamento LBP 1. Anche se prevalente, l'eziologia della LBP rimane complessa e multifattoriale. Tuttavia, disco intervertebrale (IVD) degenerazione è tra i fattori di rischio più significativi per LBP 2.

IVD è costituito da tre microstrutture: l'annulus fibrosi esterno (AF), l'interno del nucleo polposo (NP), e due placche cartilaginee che racchiudono l'intera struttura prossimale e distale 3. Con l'invecchiamento e la degenerazione, i componenti IVD cambiano strutturalmente, composizionale e meccanicamente 4. Queste modifiche comprendono la perdita di proteoglicani e idratazione del NP, diminuzione altezza del disco, ed è peggiorato competenza meccanica 5. Queste alterazioni sonospesso accompagnata da citochine che promuovono una risposta infiammatoria, così come neutrofili e radice dorsale ganglio intrusione nella cavità articolare culmina in una cascata di eventi che portano a sintomi LBP 6.

Studiando i meccanismi di degenerazione IVD è una sfida per l'uomo, perché spesso non è possibile per isolare la causa della degenerazione prima del verificarsi di lombalgia. Pertanto, un approccio riduttivo di semplificare il sistema sperimentale verso l'organo IVD consente meccanicistico messa a punto delle variabili causali ed esaminando i loro effetti a valle 5. Il sistema è ridotto a solo la popolazione di cellule nativa e circostante matrice extracellulare, permettendo così l'interpretazione diretta degli effetti degli stimoli esterni su IVD degenerazione. Inoltre, il basso costo e scalabilità di modelli murini, nonché il numero di animali geneticamente modificati 7, consentono tegli screening rapido mirato dei meccanismi degenerativi IVD e potenziali terapie. Qui, descriviamo un sistema di coltura organo murino in cui IVD cellulare e tissutale stabilità è mantenuta in 21 giorni, con particolare attenzione rivolta ai modelli omeostatici, meccaniche, strutturali e infiammatorie delle IVDs. Usando questo metodo, monitoriamo i cambiamenti funzionali IVDs' in un modello di lesione indotta stab-8 di comprendere i meccanismi alla base degenerazione del disco. Inoltre, descriviamo diverse applicazioni di questo metodo cultura organo condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione modellizzazione del IVD.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Washington University di Comitato Animal Studies St. Louis.

1. Gli animali

  1. Ottenere due ceppi di topi: 10 settimane di età BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) e 10 settimane kappa-B-luciferasi animali giornalista vecchi fattore nucleare (NF-κβ-luc) allevato in BALB / c sfondo (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
  2. Prima della dissezione, eutanasia animali con CO 2 sovradosaggio con un flusso di 2,5-3 l / min per 5 minuti seguita da un ulteriore 2 min di tempo di permanenza.
  3. Disinfettare la regione esterna dell'animale da bagno in un bagno di etanolo al 70% per 2 min prima della dissezione.

2. Dissection

  1. Eseguire un taglio verticale longitudinale sulla superficie dorsale del mouse utilizzando piccole forbici dissezione per esporre la cavità del corpo.
  2. Fare due tagli verticali longitudinali su entrambi i lati della colonna vertebrale dell'animale a partire dalla prima vertebra lombare (L1) alle vertebre caudali (C8).
  3. Usando un bisturi, pinza sottile, e forbici dissezione fine, rimuovere accuratamente la colonna vertebrale da L1-C8 dalla cavità del corpo dell'animale.
  4. rimuovere accuratamente tessuti molli circostanti eccesso sulla colonna vertebrale, assicurando nel contempo a non graffiare o danneggiare l'IVD sul lato ventrale.
  5. Ulteriormente sezionare la colonna vertebrale in vertebre-disc-vertebre spinali unità funzionali (FSU) al L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, C7 e dischi / C8.
  6. Sciacquare la FSU in soluzione salina bilanciata di Hank integrato con 1% di penicillina-streptomicina per 2 min.
  7. Casualmente assegnare i FSUs in tre gruppi: uncultured e greggia FSU (fresca), coltivate ma greggia FSU (controllo), e coltivate e stab trattati FSU (Stab).
  8. Snap congelare i campioni freschi FSU con azoto liquido immediatamente dopo la dissezione e conservare in un congelatore C -20 °.

3. Condizioni coltura d'organo

  1. Preparare 500 ml di terreni di coltura sterile di 1: 1 di Dulbecco mezzo di Eagle modificato: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12) supplementato con siero fetale bovino 20% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina.
  2. Utilizzando 10 ml pipette sierologiche, pipetta 2 ml di terreni di coltura in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti.
  3. Seguendo dissezione e risciacquare, collocare ogni FSU in un pozzo individuo nella piastra a 24 pozzetti media-riempita.
  4. Incubare i campioni in un incubatore sterile che mantiene 37 ° C, 5% di CO 2, 20% O 2 e> 90% di umidità.
  5. Dopo un periodo di coltura iniziale di 24 h, danneggiare meccanicamente i campioni Stab gruppo tramite puntura dell'anello fibroso utilizzando un ago calibro 27 sterile come mostrato nella Figura 1A.
  6. Cambiare supporto ogni 48 h preparando un nuovo 24-pozzetti di coltura-riempite, e campioni di trasferimento dal vecchio piastra alle nuove usando pinzette sterili. Aspirare i vecchi media e dispose della vecchia piastra di coltura in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
  7. L'ultimo giorno di coltura, incubare tutti i campioni supporti contenenti 0,75 mg / ml di cloruro nitro blu tetrazolio per 24 h.
  8. Successivamente bloccare tutto il FSUs con azoto liquido e conservare in un freezer a -20 ° C fino al momento prove meccaniche o istologia (Figura 1B).

4. Misure longitudinali NF-kB

  1. Immagine del FSU da animali NF-κβ-luciferasi a 1, 5, 13, e 19 giorni per valutare l'espressione di NF-kB.
  2. Aggiungere 10 microlitri di 1 mg / mL di soluzione luciferina ciascun pozzetto ed incubare in un incubatore sterile a 37 ° C per 10 min.
  3. Immagine i campioni per bioluminescenza utilizzando il sistema di imaging con un tempo di esposizione 1 min e l'impostazione bin 2.
  4. Contemporaneamente, utilizzare la macchina per scattare una fotografia e sovrapporre l'immagine è bioluminescenza con per determinare la posizione anatomica della luminescenza nel IVD.
  1. Determinare il comportamento meccanico dei IVD mediante compressione dinamica spostamento controllato 9.
  2. Utilizzando un microscopio dissezione, bisturi e pinzette, rimuovere i corpi vertebrali ossee del FSU da ciascun campione mantenendo intatto e attaccato al IVD le placche terminali cartilaginee.
  3. Fissare le IVD isolato ad una piastra di alluminio 1 cm x 1 cm x 0,2 centimetri con colla di cianoacrilato.
  4. Misurare l'altezza del disco e larghezza considerando una media di tre misurazioni sull'asse longitudinale di ciascun disco utilizzando un micrometro laser. Calcolare il rapporto di altezza del disco dividendo l'altezza media disco per la larghezza massima del disco.
  5. Utilizzare l'altezza del disco misurata per calcolare i valori di deformazione ingresso utilizzati in prove meccaniche. Si noti che l'altezza media disco era approssimativamente 690 um ± 39 um.
  6. Porre i campioni in un tampone fosfato salino bagno sotto il compressisulla macchina e precaricare il disco da 0,02 N.
  7. Ciclicamente comprimere il disco utilizzando una forma d'onda sinusoidale a 1 Hz per 20 cicli a livello di deformazione 1% e livello di deformazione 5% per 3 prove ciascuno e registrare i valori di carico e spostamento della IVD. Attendere 10 min di tempo di riposo tra le prove per il disco per rilassarsi e per evitare lesioni.
  8. Calcolare la media rigidità dalla fase di carico dell'ultimo ciclo, e calcolare la tangente di perdita dall'angolo di fase tra i dati di carico e di spostamento.

6. Proteoglycan e Collagene Quantificazione

  1. Seguendo prove meccaniche, misurare il peso umido disco posizionando l'IVD isolato in una provetta da centrifuga pre-tarato e misurando il peso con una bilancia analitica.
  2. Digerire i IVD isolati in 250 microlitri soluzione di digestione papaina (0,1 M di acetato di sodio, EDTA 0,01 M, 0,005 M cisteina HCl, pH 6,4) per una notte a 65 ° C utilizzando un riscaldatore blocco.
  3. campioni di centrifugazione per 10 mina 2.000 xg e raccogliere il liquido surnatante.
  4. Misurare il contenuto di proteoglicani della IVD utilizzando il saggio (DMMB) metilmetilene blu con standard condroitina solfato.
  5. Preparare la soluzione DMMB (21 mg DMMB, 5 mL di etanolo assoluto, 2 g di formiato di sodio in 1 L DDH 2 O).
  6. Pipettare 30 ml di standard e campioni in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti, insieme a 250 ml di soluzione DMMB in ciascun pozzetto.
  7. Leggere l'assorbanza della piastra a 525 nm utilizzando uno spettrofotometro.
  8. Misurare il contenuto di collagene utilizzando un kit di analisi idrossiprolina secondo le istruzioni del produttore.

7. Istologia

  1. Fissare un sottoinsieme di campioni in paraformaldeide al 4% per 24 h, de-calcify in acido formico al 5% per 48 ore, disidratare con etanolo, e incorporare in paraffina.
  2. Utilizzando un microtomo, sezione sagittale i campioni a 10 micron di spessore e applicare le sezioni per vetrini. Macchiare le sezioni usando safranina-O / Fast Green e DAPI.
  3. Utilizzando un microscopio ottico, immagine scorre a ingrandimento 10X.

8. Contrast-enhanced microComputed Tomografia (microCT)

  1. Scansione di un sottoinsieme di campioni al momento del dato 0, 2, 5, e 7 giorni utilizzando longitudinale ioversol contrasto enhancement 10, e terminale acido fosfomolibdico (PMA) contrasto enhancement al punto temporale di 7 giorni.
  2. 4 h prima microCT tempo di scansione, aggiungere 300 ml di 350 mg / mL di soluzione di iodio ioversol ai terreni di coltura per una concentrazione finale di circa 50 mg / soluzione ioversol contenenti iodio ml e incubare in un incubatore sterile a 37 ° C per 4 h.
  3. Dopo l'incubazione, il campione avvolgere in garza sterile e posto in una provetta 1 ml.
  4. I campioni del sistema microCT e scansione a 45 keVp, 177 uA, 10,5 um dimensione voxel, e 300 ms integrazione.
  5. Esportare dati dal microCT come file DICOM e visualizzare con il software (
  6. Al punto di tempo di 7 giorni, fissare campioni utilizzando una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da una soluzione PMA 5% per 3 giorni, e la scansione utilizzando le stesse impostazioni come quelli utilizzati in fase 8.4.

9. Tridimensionale di modellazione agli elementi finiti

  1. Segmento i file DICOM dei IVD utilizzando il software con della soglia manuale (per esempio, OsiriX).
  2. Convertire i volumi NP e AF della IVD in mesh di elementi finiti voxel-based utilizzando MeshLab.
  3. Combinare le microstrutture della NP e AF per formare un IVD completa ed applicare condizioni al contorno determinate sperimentalmente nel software elementi finiti.

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Representative Results

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Le figure 2-3 mostrano risultati rappresentativi della distribuzione dei proteoglicani, espressione NFKB, rigidità, viscosità, altezza del disco e peso umido per IVD coltivate mouse. Se coltivate correttamente, i parametri IVD del gruppo di controllo non dovrebbe essere significativamente diverso dal gruppo Fresh. Se la coltura è infetto o comunque compromessa, il gruppo di controllo sarà diverso dal gruppo fresco, specialmente nell'espressione NFKB e distribuzione proteoglicani (risultati non mostrati). Le figure 4-5 mostrano le applicazioni di coltura organo all'utilizzo microCT contrasto migliorato per ottenere un modello tridimensionale del DIV; inoltre, elementi finiti può essere applicato a tali strutture per determinare distribuzioni di stress tissutale e deformazione a causa del comportamento meccanico globale.

Figura 1
Figura 1. SperimentalePanoramica. (A) unità funzionali disco intervertebrale spinale (FSU) sono stati sezionati dal lombare e segmenti caudali; la FSUs conteneva due vertebre intatti, le placche terminali cartilaginee, e il disco intervertebrale. (B) Dopo dissezione, i campioni sono stati divisi in gruppi di trattamento e coltivate in vitro per 21 giorni. Successivamente, un sottoinsieme di campioni è stato utilizzato per prove meccaniche e saggi biochimici, mentre un altro sottoinsieme di campioni è stato utilizzato per l'analisi istologica. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 2. Istologia ed espressione NFKB. (A) Dopo 21 giorni di coltura, safranina O colorazione (rosso) indica che il contenuto sia mantenuto proteoglicanisia nel AF e NP nei campioni di controllo. (B) I campioni Stab (sito di puntura indicato dalla freccia) mostrava diminuita contenuto di proteoglicani sia nel AF e NP. (C) Tetrazolium colorazione blu (blu) mostra co-localizzazione. (D) colorazione DAPI indica che le cellule sono metabolicamente attive e vitali dopo 21 giorni di coltura organo. Espressione (E) NFKB in entrambi i campioni di controllo e Stab indicano anche che l'IVD è vitale e sensibile al suo ambiente. I campioni sono Stab aumento dell'espressione NFKB a 1, 5, 13, e punti di tempo di 19 giorni. IVD lombari sono mostrati qui. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 3. Meccanica e composizione. ( B) Prove meccaniche ha mostrato che i livelli di deformazione 1% e 5%, valori tangenti campione rigidità e perdita Stab sono relative inferiori per controllare campioni. (C - D) saggi biochimici hanno dimostrato che, per composizione, i campioni avevano Stab proteoglicani inferiori e contenuto di collagene (normalizzato a umido peso) rispetto al controllo campioni. (E - F) Strutturalmente, campioni Stab aveva un rapporto di diminuzione dell'altezza del disco e peso umido rispetto ai controlli. Meccanicamente, composizionale e strutturale, i valori campioni freschi e controllo non erano significativamente differenti tra loro. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 4. microCT visualizat Contrast-enhancedionico. microCT mdc può essere utilizzato per visualizzare l'IVD in tre dimensioni durante il periodo di coltura. IVD caudali sono mostrati qui. Il differenziale legame ioversol al AF (bassa attenuazione) e NP (maggiore attenuazione) permette di distinguere l'AF dalla NP. Viceversa, PMA lega preferenzialmente ai residui di collagene nella AF (maggiore attenuazione), le piastre laterali e notocorda. Le immagini sono state visualizzate usando il colore tale che bianco rappresenta elevata attenuazione, giallo rappresenta medie attenuazione, e rosso rappresenta bassa attenuazione. (A - E) vista sagittale del IVD nei giorni 0, 2, 5, e 7 con contrasto ioversol, e con un contrasto PMA. (F - J) vista trasversale della IVD nei giorni 0, 2, 5 e 6 con un contrasto ioversol, e con un contrasto PMA. IVD caudali sono mostrati qui. Cliccate qui per vedere allaVersione rger di questa figura.

Figura 1
Figura 5. Elemento modellazione finiti (FEM) della struttura IVD. analisi FEM è un potente strumento matematico che consente il calcolo della risposta materiale locale a condizioni al contorno più grandi. Ad esempio, (A) il NP può essere reso separatamente (B) AF, e ogni comparto potrebbe essere assegnato uniche proprietà costitutive. (C) Un combinato struttura IVD sia con AF e NP è mostrato in 3D. Quando i carichi assiali sono applicati al disco sulla piastra di estremità superiore con la piastra di estremità inferiore è un bordo fisso, possiamo determinare le concentrazioni locali di stress e tensioni. Giallo punti e frecce nere rappresentano un carico nodale applicato. Fare clic qui per visualizzare unpiù grande versione di questa figura.

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Discussion

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Questo protocollo descrive una cultura organo del murino FSU con enfasi sul monitoraggio dei cambiamenti biologici nel IVD. La corretta gestione di queste colture richiede attente tecniche sterili. In particolare, la dissezione passi 2.1-2.6 e la cultura passi 3.1-3.6 richiedono particolare cura per assicurare condizioni di sterilità sono mantenuti, e questi passaggi deve essere eseguita preferibilmente in una stanza procedura isolato con un flusso d'aria HEPA per minimizzare contaminanti. Poiché il processo di dissezione provoca traumi ai tessuti, è richiesto il periodo precondizionamento 24 h in 3.5 per tutti i gruppi di trattamento inclusi i controlli. I saggi di vitalità possono essere utilizzati per garantire campioni sono vivi e non contaminato, e servono anche come una conferma che l'omeostasi cellulare è mantenuta. Le letture luminescenza NFKB possono essere utilizzati anche per monitorare longitudinalmente la risposta infiammatoria della coltura FSU; un aumento di NF-kB expresslitio durante la coltura potrebbe indicare la FSU sono contaminati o altrimenti sotto stress da infezione 11, e quindi comprendono qui come un possibile passaggio di risoluzione. Infine, il confronto ai gruppi freschi fungono da punto di controllo aggiuntivo per i campioni in coltura di controllo in istologia e prestazioni meccaniche. Questa tecnica cultura è suscettibile di campioni multipli per piastra, e nella nostra esperienza, fino a 24 campioni su una piastra da 24 pozzetti può essere facilmente realizzata. Tuttavia, la multiplazione dei campioni propaga anche il rischio di contaminazione incrociata e pertanto, si consiglia di FSU essere coltivate su piatti separati durante la risoluzione. Inoltre, mentre questo protocollo fornisce istruzioni per un periodo di coltura di 21 giorni, lo stesso metodo può essere utilizzato per periodi di coltura che sono più o meno lungo. FSU messi in coltura con successo dal nostro laboratorio per periodi di cultura che vanno da 1 settimana per 5 settimane.

Like tutti i modelli, modelli di coltura organo a murino hanno dei limiti, in particolare nella loro capacità di catturare le condizioni di carico degli umani. Ci sono anche sottili differenze nella geometria tra l'murine e umane IVD 12, e gli esseri umani sono bipedi con carichi assiali in primo luogo sulla colonna vertebrale, mentre ratti e topi sono quadrupedi. Tuttavia, poiché la condizione colta è relativamente scaricato nella sua forma attuale, la modalità di caricamento è probabile che non hanno influenzato le IVD. Altri sistemi come modelli di coltura IVD bovina organo 13, 14 possono essere più adatto per interazioni meccaniche e di carico. I lavori futuri incorporerà condizioni di carico per permettere l'indagine delle interazioni tra fattori mechanobiological meccaniche e ambientali. La potenza di questo approccio risiede nella sua consistenza, versatilità e capacità di imaging ad alta risoluzione. Il nostro approccio qui dimostra che è possibile la cultura Blombare OTH e IVD caudali, ma è importante notare che questi dischi sono anatomicamente diversi nei vari invecchiamento e sviluppo 15. Come tale, il nostro disegno sperimentale randomizza lombare e livelli caudali separatamente.

microCT mdc permette ad alta risoluzione, non distruttiva, immagini tridimensionali del IVD. mezzi di contrasto differenti possono essere utilizzati per evidenziare diversi aspetti compositivi della IVD. Dimostriamo qui l'uso di ioversol, un non citotossica agente idrofilo contenenti iodio 10, e l'acido fosfomolibdico (PMA), una molecola di heavy-metal che chela a residui aminoacidi collagene. L'utilizzo di questi agenti di contrasto-, le caratteristiche microstrutturali del IVD possono essere evidenziati e identificati. Ioversol differenzia l'idratazione relativa dei tessuti IVD, fornendo così il contrasto tra il nucleo polposo ricco d'acqua e fibroso meno idratata.Il PMA fornisce differenziazione di composizione relativa collagene nei tessuti e metterà in evidenza le piastre terminali, fibroso, e notocorda. Ioversol può essere utilizzato durante la coltura per determinare le variazioni longitudinali idratazione, mentre PMA può essere applicato alla IVD nel punto terminale di coltura per monitorare le variazioni di collagene.

Le future applicazioni di questa tecnologia includono utilizzando altri ceppi di topi transgenici e knockout per comprendere i diversi aspetti della IVD degenerazione in altre malattie. Inoltre, è una piattaforma potenziale di co-coltura con altri sistemi di organi e cellule, come gangli della radice dorsale per identificare interazioni che possono contribuire alla degenerazione IVD.

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Disclosures

Gli autori di questo manoscritto dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Washington University muscoloscheletrico Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, e NIH K01AR069116. Gli autori desiderano ringraziare Patrick Wong per il suo contributo nella raccolta dei dati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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