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Bioengineering

doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

척추 디스크 (IVD)의 전체 기관 배양 물은 세포 외 기질 원시 세포 표현형, 및 세포 - 기질 상호 작용을 보존한다. 여기에서 우리는 마우스 요추 및 기능적 척추 단위 꼬리, 사후 관리 및이 시스템을 이용한 여러 응용 프로그램을 사용하여 체외 배양 시스템을 설명합니다.

Abstract

척추 디스크 (IVD)의 변성은 요통에 크게 기여. IVD는 전송 및 척추에 부하를 저해하는 역할을하는 섬유 연골 관절이다. IVD는 프로테오글리칸 풍부한 수핵 (NP) 및 연골 단부 플레이트에 의해 협지 된 콜라겐이 풍부한 고리 섬유증 (AF)로 구성된다. 서로 인접 척추와 척추-IVD 구조는 기능 척추 유닛 (FSU)을 형성한다. 이 미세 고유 세포 유형뿐만 아니라 고유의 세포 외 매트릭스를 포함한다. 구소련의 전체 기관 문화는 원시 세포 외 기질, 세포 분화 표현형 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 따라서, 기관 배양 기술은 IVD의 복잡한 생물학적 메커니즘을 조사하는 데 특히 유용하다. 여기, 우리는 IVD에 대한 질병 메커니즘과 치료법을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다 전체 요추 마우스 Fsus를 배양을위한 높은 처리량 방법을 설명합니다. 또한, 우리는의를 설명조영 증강 microCT 이미징 및 IVD 입체 고해상도 유한 요소 모델링을 포함하여 추가 연구를 수행이 장기 배양 방법을 이용하는 애플리케이션 everal.

Introduction

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요통 (LBP)는 직장에서의 글로벌 장애에 대한 주요 요인 및 생산성 손실, 그리고 미국인들은 혼자 LBP 치료 50 억 달러의 초과 지출. 유행이지만, LBP의 원인은 복잡하고 다원적 남아있다. 그러나 척추 디스크 (IVD)의 변성은 LBP 2의 가장 중요한 위험 인자 중 하나입니다.

IVD 세 마이크로 제조된다 : 외부 환형 섬유증 (AF), 내부 수핵 (NP), 및 근위부와 원위부 (3) 전체의 구조를 끼우는 두 연골 종판. 노화와 퇴행으로, IVD 구성 요소는 구성 적, 구조적 변화, 기계적 4. 이러한 변화가 NP의 프로테오글리칸 및 수분의 손실을 포함하는, 디스크 높이의 감소, 및 기계적 능력을 저하 5. 이러한 변화는종종 LBP 현상 6 이어질 사건 캐스케이드 절정 공동 공간으로 염증 반응뿐만 아니라, 호중구 및 후근 신경절 침입을 촉진 사이토킨 수반.

이 요통의 발생 전에 변성의 원인을 분리하는 것이 불가능하기 때문 IVD 변성의 메커니즘을 공부하는 것은 인간의 도전이다. 따라서, IVD 기관에 이르기까지 실험 시스템을 단순화의 환원 주의적 접근 방식은 인과 변수의 기계적 미세 조정을 할 수 있으며 자신의 다운 스트림 효과 (5) 검사. 이 시스템은 따라서 IVD 퇴화에 외부 자극 효과의 직접적인 해석을 가능하게 만 원시 세포 집단 및 세포 외 기질을 둘러싸는 감소된다. 또한, 낮은 비용과 생쥐 모델의 확장 성뿐만 아니라, 유전자 변형 동물 (7)의 많은 수의, t 허용IVD 퇴행성 메커니즘과 잠재적 치료의 그는 빠른 대상으로 심사. 여기서는 IVD 세포 및 조직 안정성, 사후 관리가 '항상성 기계적 구조, 및 염증성 패턴 주어진 특정 포커스 21 일 이상 유지되는 뮤린 기관 배양 시스템을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 디스크의 변성 뒤에 메커니즘을 이해하는 자상에 의한 손상 모델 (8)에서, 사후 관리 '기능의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 더욱이, 우리는 조영 증강 microCT 이미징 및 IVD 입체 고해상도 모델링 포함한 추가 연구를 수행하는 기관이 배양 방법의 여러 애플리케이션을 설명한다.

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Protocol

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모든 동물 실험은 세인트 루이스 동물 연구위원회의 워싱턴 대학을 준수 하였다.

1. 동물

  1. (N = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) 및 10 주령 핵 인자 카파 B - 루시퍼 라제 리포터 동물들 (NF-κβ 뤽)는에 자란 10 주령의 BALB / C : 마우스의 두 가지 변종을 구하는 BALB / C 배경 (N = 6, BALB / C-(TG RELA 뤽) 31Xen).
  2. 해부하기 전에, 시간 거주지의 추가 2 분,이어서 5 분 동안 2.5-3 L / min의 유량으로 CO 2 과량으로 동물을 안락사.
  3. 박리 전에 2 분 동안 70 % 에탄올 욕에서 입욕하여 동물의 외측 영역 소독.

2. 해부

  1. 체강 노출되도록 절개 작은 가위를 사용하여 마우스의 등쪽 표면에 길이 방향의 수직 절단을 확인.
  2. 부터 동물의 척추의 양쪽에 두 개의 길이 방향의 수직 절단을 확인제 요추 척추 꼬리로 (L1) (C8).
  3. 메스 미세 겸자 미세 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 동물의 체강 내에서 L1-C8의 척추를 제거한다.
  4. 긁어 또는 복부 측 IVD을 손상하지 않도록 보장하면서 조심스럽게 척추 주변 초과 연조직을 제거한다.
  5. 또한, L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 및 C7 / C8 디스크에서 척추 디스크 - 척추 기능 척추 유닛 (Fsus를)로 척추 해부.
  6. 1 % 2 분 동안 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 행크 평형 염 용액에 Fsus를 씻어.
  7. 교양 및 치료 Fsus를 (신선한), 배양 그러나 치료 Fsus를 (제어), 배양 및 찔린 처리 Fsus를 (스탭) : 무작위로 세 그룹으로 Fsus를 할당합니다.
  8. 스냅 즉시 -20 ° C의 냉동고에서 해부하고 저장 한 후 액체 질소로 신선한 FSU 샘플을 동결.

3. 장기 문화 조건

  1. 멸균 배지 500㎖의 준비 1 : 둘 베코 변형 이글 배지 : 영양 혼합물 F12 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 (DMEM F12).
  2. 24 웰 배양 플레이트의 각 웰에 10 ㎖의 혈청 피펫, 피펫 배양액 2 ㎖의 사용.
  3. 절개를 따라 린스 미디어 채워진 24 웰 플레이트의 개별 웰에 서로 FSU를 배치했다.
  4. 37 ° C, 5 % CO 2, 20 % O 2 및> 90 %의 습도를 유지하고 멸균 배양기에서 샘플을 인큐베이션.
  5. 24 시간의 초기 배양 기간 후, 기계적으로도 1a에 도시 된 바와 같이 무균 27 게이지 바늘을 사용하여 섬유륜의 바늘 구멍을 통해 스터브 군 샘플 손상.
  6. 새로운 사용 무균 핀셋 오래 플레이트로부터 새로운 미디어 채워진 24 웰 배양 플레이트를 준비하여 미디어마다 48 시간을 변경하고, 이전 샘플. 기존의 미디어와 dispos을 대기음생물 학적 폐기물 빈의 옛 문화 판의 전자.
  7. 배양의 마지막 날에, 24 시간 동안 0.75 ㎎ / ㎖ 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드를 함유하는 배지에서 모든 샘플을 배양한다.
  8. 그 후, 동결 모든 Fsus를 기계적 시험 또는 조직학 (도 1b)에 대한 준비를 할 때까지 -20 ℃ 냉동고에서 액체 질소와 함께 점포.

4. 경도 측정 NF-κB

  1. 이미지는 1에서 NF-κβ - 루시 페라 동물 Fsus를, 5, 13, 19 일 NF-κB의 발현을 평가합니다.
  2. 10 분 동안 37 ℃에서 멸균 배양기에서 각각 1 ㎎ / ㎖의 루시페린 용액 10 μL를 첨가하고 잘 배양한다.
  3. 이미지 1 분의 노출 시간 및 (2)의 빈 설정으로 촬상 시스템을 이용하여 생물 발광 용 샘플.
  4. 동시에, 사진을 가지고와 IVD에 발광의 해부학 적 위치를 결정하기 위해 생물 발광 이미지와 오버레이 기계를 사용합니다.
  1. 변위 제어 동적 압축 9를 사용하여, 사후 관리의 기계적 거동을 결정한다.
  2. 손상 및 IVD에 부착 된 연골 종판 유지하면서 해부 현미경 메스와 핀셋을 사용하여, 각 시료에서의 FSU 뼈 추체를 제거한다.
  3. 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 이용하여 1cm X 1cm X 0.2 cm의 알루미늄 판으로 격리, 사후 관리를 첨부.
  4. 레이저 마이크로 미터를 이용하여 각 디스크의 세로축에 3 개 회 측정의 평균을 취함으로써, 디스크의 높이 및 폭을 측정한다. 디스크의 최대 폭의 평균 디스크 높이를 나눈 디스크 높이 비율을 계산한다.
  5. 기계적 시험에 사용되는 입력 스트레인 값을 계산하기 위해 측정 된 디스크 키를 사용한다. 디스크의 평균 높이는 약 690 ㎛의 ± 39 ㎛, 참고.
  6. compressi 하에서 인산 완충 식염수 용기에 샘플을 놓고기계 0.02 N.에 디스크를 미리로드
  7. 순환 시험 3 20 1 %의 변형 수준 및 사이클 5 % 스트레인 레벨 1 Hz에서 각각 정현파를 사용하여 디스크를 압축 및 IVD의 하중과 변위 값을 기록한다. 긴장과 손상을 방지하기 위해 시험 디스크 사이의 휴식 시간이 10 분을 허용한다.
  8. 최종 사이클의 로딩 단계로부터의 평균 강도를 계산하고, 변위 및 하중 데이터 사이의 위상 각의 정접을 계산한다.

6. 프로테오글리칸 및 콜라겐 정량화

  1. 기계적 시험에 따라, 미리 칭량 한 원심 관에 분리 배치 IVD 및 분석 저울을 사용하여 중량을 측정함으로써 디스크 습윤 중량을 측정한다.
  2. 250 μL의 파파인 소화 용액을 분리, 사후 관리 다이제스트 (0.1 M 아세트산 나트륨, 0.01 M EDTA, 0.005 M 염산 시스테인, pH를 6.4) 블록 히터를 사용하여 밤새 65 ° C에서.
  3. 10 분 동안 원심 분리 샘플2,000 XG의 상청액을 수집하고.
  4. 콘드로이틴 설페이트 표준과 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB) 분석을 사용하여 IVD의 프로테오글리칸 함량을 측정.
  5. DMMB 용액 (21 mg을 DMMB 5 mL의 무수 에탄올 1 L DDH 2 O 2 g을 포름산 나트륨)을 준비한다.
  6. 각 웰에 피펫 DMMB 용액 250 μL와 함께 96 웰 플레이트에서 30 중으로 표준 μL 샘플.
  7. 분광 광도계를 사용하여 525 nm에서 플레이트의 흡광도를 읽는다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 히드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 콜라겐 함량을 측정한다.

7. 조직학

  1. 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 샘플들의 서브 세트를 수정을 48 시간 동안 5 % 포름산 탈 석회 성으로 만들다, 에탄올로 탈수시키고, 파라핀에 삽입.
  2. sagittally 10 개 μm의 두께 부, 샘플을 마이크로톰을 사용하여 유리 슬라이드에 적용 섹션. Safranin-O / 빨리 할머니를 사용하여 섹션을 얼룩EEN 및 DAPI.
  3. 광학 현미경을 사용하여, 이미지는 10 배 배율로 슬라이드.

제 조영 증강 microComputed 단층 촬영 (microCT)

  1. 7 일의 시점에서 길이 Ioversol의 콘트라스트 향상 10 단자 인 몰리브덴 산 (PMA), 콘트라스트 강조를 사용하여 0, 2, 5, 7 일 시점에서의 샘플의 일부를 스캐닝.
  2. microCT 스캔 시간에 앞서 4 시간, 4, 37 ° C에서 멸균 배양기에서 350 밀리그램 / 약 50 ㎎ / ㎖ 요오드 함유 Ioversol 용액의 최종 농도를위한 배양 배지에 ㎖의 요오드 Ioversol 용액 300 μL를 추가 부화 시간.
  3. 인큐베이션 후, 1 ㎖의 마이크로 원심 튜브에의 멸균 거즈 장소에서 샘플 랩.
  4. microCT 시스템 플레이스 샘플 45 keVp 177 μA, 10.5 μm의 복셀 사이즈, MS (300)에 통합 검색.
  5. 수출 DICOM 파일로 microCT 데이터와 소프트웨어를 사용하여 시각화 (
  6. 7 일 시점에서 3 일 동안 5 % PMA 용액을이어서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 사용하여 샘플을 고정하고, 단계 8.4에서 사용 된 것과 동일한 설정을 사용하여 검사한다.

제 3 차원 유한 요소 모델링

  1. 세그먼트 수동 임계 값 (예를 들어, OsiriX)와 소프트웨어를 사용하여, 사후 관리의 DICOM 파일.
  2. Meshlab를 사용하여 복셀 기반 유한 요소 메쉬로 IVD의 NP 및 AF 볼륨 변환.
  3. 완전한 IVD를 형성하고 유한 요소 소프트웨어에서 실험적으로 결정 경계 조건을 적용 NP와 AF의 미세 구조를 결합합니다.

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Representative Results

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도 2-3 배양 마우스, 사후 관리를위한 분배 프로테오글리칸, NF-κB의 발현 강도, 점도, 디스크 키, 습윤 중량의 대표적인 결과를 나타낸다. 제대로 배양하면, 제어 그룹의 IVD 매개 변수는 신선한 그룹에서 유의 한 차이를해서는 안됩니다. 문화가 손상 달리 감염 또는 경우, 대조군 특히 NF-κB의 발현과 프로테오글리칸 유통의 신선한 그룹에서 다른 것입니다 (결과는 도시하지 않음). IVD의 입체 모델을 구하는 조영 증강 microCT를 사용하여 장기 배양 4-5 표시 애플리케이션을 도시한다; 또한, 유한 요소 모델링에 의한 글로벌 기계적 행동 조직 응력과 변형 분포를 결정하기 위해 이러한 구조에 적용될 수있다.

그림 1
그림 1. 실험개요. (A) 추간판 기능 척추 유닛 (Fsus를)은 허리와 꼬리 부분 해부 하였다; Fsus를 두 그대로 척추 연골 종판과 추간판이 포함되어 있습니다. 절개 후 (B), 샘플을 21 일 동안 시험 관내에서 처리 군으로 나누어 배양 하였다. 샘플의 다른 부분 집합 조직 학적 분석을 위해 사용되는 동안 그 후에, 샘플들의 서브 세트, 기계 시험 및 생화학 적 분석에 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1
그림 2. 조직학 및 NF-κB 식입니다. 배양 21 일후 (A)는, Safranin O 염색 (적색) 프로테오글리칸 내용이 유지되는 것을 나타내고컨트롤 샘플에서 AF 및 NP 모두있다. (B) 샘플 스터브 (화살표로 나타낸 천자 부위)는 AF 및 NP 모두 프로테오글리칸 함량이 감소 하였다. (C) 테트라 졸륨 블루 염색 (청색)은 공동 제이션을 나타낸다. (D) DAPI 염색 세포 대사 활성 및 기관 배양 21 일 후 가능한 것을 보여준다. 컨트롤 및 찔러 샘플 모두에서 (E) NF-κB의 발현 또한 IVD이 가능한 및 환경에 반응을 나타냅니다. 스터브 샘플은 1, 5, 13에서 NF-κB의 발현이 증가하고, 19 일 시점있다. 요추, 사후 관리가 여기에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1
3. 역학과 구성을 그림. ( B) 기계적 테스트는 1 %와 5 %의 변형 수준에서 찔러 샘플 강성 및 손실 탄젠트 값은 샘플을 제어하기 위해 낮은 상대임을 보여 주었다. (C - D) 생화학 적 분석은 구성 상, 샘플 하부 찔러 프로테오글리칸 샘플들을 제어하기 위해 상대 (습윤 중량 정규화) 콜라겐 함량 것으로 나타났다. (E - F)의 구조적 스터브 샘플 컨트롤 감소 디스크 높이 비율 습윤 중량 기준으로했다. 기계적, 구성 적, 구조적, 신선한 및 제어 샘플 값은 서로 유의 한 차이가 없었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1
도 4 조영 증강 microCT의 visualizat이온. 조영 증강 microCT은 배양 기간 동안 세 차원에서 IVD을 시각화 할 수있다. 꼬리, 사후 관리가 여기에 표시됩니다. AF에 Ioversol (저급 감쇠) 및 NP (높은 감쇠)의 결합 미분 한 NP는 AF에서 구별 할 수있다. 반대로, PMA 우선적 AF (높은 감쇠)은 종판 및 척색 콜라겐 잔기에 결합한다. 이미지는 화이트 옐로우 매체 감쇠를 나타내고, 높은 감쇄를 나타낸다되도록 색을 사용하여 시각화하였고, 적색 낮은 감쇠를 나타낸다. (A - E)의 시상 Ioversol 콘트라스트 일 0, 2, 5에서 IVD 및 7의 뷰 및 PMA의 콘트라스트. (F - J) 횡 일 0, 2, 5에서 IVD의 뷰 및 Ioversol 대비 6 및 PMA의 콘트라스트. 꼬리, 사후 관리가 여기에 표시됩니다. 라를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rger 버전.

그림 1
IVD 구조도 5 유한 요소 모델 (FEM). FEM 분석은 큰 경계 조건에 국부적 소재 응답의 계산을 가능하게하는 수학적 강력한 도구이다. 예를 들어, (A)가 NP는 (B)가 AF 별도로 표현 될 수 있고, 각 구획은 독특한 구조적 특성을 부여 할 수있다. AF 및 NP 모두 (C) 조합 된 IVD 구조 3D에 도시된다. 축 방향 하중이 하부 단부 판과 단부 판에 우수한 디스크에 고정 된 에지 인 적용하면, 우리는 응력과 변형률의 국소 농도를 결정할 수있다. 황색 점 및 검은 화살표는 노달 하중이인가되는 것을 나타낸다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.

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Discussion

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이 프로토콜은 IVD의 생물학적 변화를 모니터링에 중점을두고 쥐의 FSU의 장기 문화를 설명합니다. 이러한 문화의 성공적인 유지 보수주의 멸균 기술을 필요로한다. 특히, 박리는 2.1-2.6 단계 배양은 3.1-3.6 무균 상태가 유지되도록하기 위해 특별한주의를 필요로 단계,이 단계는 오염을 최소화하는 HEPA 공기 흐름과 격리 절차 방에서 바람직하게 수행되어야한다. 절개 과정 조직 외상을 초래하기 때문에, 3.5에서 24 시간 전처리 기간은 컨트롤을 포함하여 모든 처리 군에 대해 필요하다. 생존력 분석은 샘플과 오염되지 않은 살아있는되도록, 또한 세포의 항상성을 유지하는 역할을 확인하기 위해 사용될 수있다. NF-κB 발광 수치는 Fsus를 배양의 염증 반응을 모니터링 종으로 사용될 수있다; NF-κB의 빠른 증가Fsus를을 나타낼 수 문화 동안 이온 오염되거나 감염이 11에서 스트레스, 우리는 따라서 가능한 문제 해결 단계로 여기에 포함된다. 마지막으로, 신선한 그룹에 비교 조직학 및 기계적 성능에서 제어 배양 샘플에 대한 추가 검사 점 역할을합니다. 이 문화 기술은 판에 여러 샘플 의무이며, 우리의 경험에서, 24 웰 플레이트에 최대 24 개 개의 샘플을 쉽게 수행 할 수 있습니다. 그러나, 샘플의 다중 또한 교차 오염의 위험을 전파함으로써, Fsus를이 문제를 해결하는 동안 별도의 접시에 배양하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜 21 일 문화 기간에 대한 지침을 제공하면서 또한, 같은 방법으로 길거나 짧은 배양 기간 동안 사용할 수 있습니다. Fsus를 성공적으로 일주 5 주까지 배양 기간 동안 우리가 실험실에서 배양되었다.

엘이케 모든 모델 생쥐에서 기관 배양 모델은 특히 인간의 하중 조건을 포착하는 능력에 한계가있다. 이 쥐와 인간, 사후 관리 (12) 사이의 구조에 미묘한 차이도 있고, 쥐가 네발 동안 인간은 척추에 주로 축 하중과 두발 있습니다. 배양 조건이 상대적으로 현재의 형태로 언로드되기 때문에, 사후 관리에 영향을하지에 그러나,로드 모드는 가능성이 높습니다. 이러한 소 IVD 기관 배양 모델로 다른 시스템 (13) (14)는 기계적 하중 작용에 더 적합 할 수있다. 미래의 작업은 기계 및 환경 요인 간의 mechanobiological 상호 작용의 조사를 가능하게 하중 조건을 통합 할 예정이다. 이 방법의 힘은 고해상도 영상에 대한 일관성, 다양성, 및 기능에있다. 여기에 우리의 접근 방식은 문화 B에 가능하다는 것을 보여줍니다OTH 허리와 꼬리, 사후 관리하지만, 이러한 디스크는 노화 및 개발 (15)에서 해부학 적으로 다르다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 우리의 실험 설계는 요추와 별도로 꼬리 수준을 무작위로.

조영 증강 microCT은 IVD의 고해상도 비파괴, 3 차원 화상을 허용한다. 다른 조영제는 IVD의 서로 다른 조성의 측면을 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 여기 Ioversol, 요오드 함유 친수성 비 세포 독성 제 (10) 및 몰리브덴 산 (PMA), 콜라겐 아미노산 잔기 킬레이트 화합물 무거운 금속 분자의 사용을 입증한다. 이러한 대비 에이전트를 사용하여 IVD의 미세 기능이 강조하고 식별 할 수 있습니다. Ioversol함으로써 물이 풍부한 수핵 및 덜 수화 섬유륜 사이의 대조를 제공 IVD 조직의 상대적 수분 차별화.PMA가이 조직에 비해 콜라겐 조성물의 차별화를 제공하고, 최종 판 섬유륜 및 척색을 강조한다. PMA 콜라겐의 변화를 모니터링하는 문화의 말단 지점에서 IVD에 적용 할 수 있지만 Ioversol는 수화의 길이 변화를 결정하기 위해 배양시에 사용될 수있다.

이 기술의 미래 응용 프로그램은 다른 질병에 IVD 변성의 다양한 측면을 이해하는 형질 전환 및 녹아웃 생쥐의 다른 균주를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 변성 IVD에 기여할 수있는 상호 작용을 식별하는 등의 후근 신경절과 같은 다른 기관 시스템과 세포와 공 배양을위한 잠재적 인 플랫폼입니다.

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Disclosures

이 논문의 저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 워싱턴 대학 근골격계 연구 센터 (NIH의 P30의 AR057235), 분자 이미징 센터 (NIH의 P50의 CA094056), 제어 공학 교육 그랜트 (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, 및 NIH K01AR069116에 의해 지원되었다. 저자는 데이터 수집에서 그의 공헌 패트릭 웡에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
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Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

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