Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

doi: 10.3791/55437 Published: April 11, 2017

Summary

Всего органной культура межпозвонкового диска (МПД) сохраняет нативный внеклеточный матрикс, клеточные фенотипы и клеточно-матрица. Здесь мы опишем систему IVD культуры с использованием поясничных мышей и хвостовые IVDs в их функциональных спинальных узлах и несколько приложений, использующих эту систему.

Abstract

Межпозвоночный диск (IVD) дегенерация является существенным фактором низкой боли в спине. IVD является соединение, которое относящийся к волокнистой хрящевой ткани служит для передачи и смочить нагрузок в позвоночнике. IVD состоит из протеогликанов богатых студенистого ядра (НП) и богатый коллаген пульпозного (AF), зажатого с помощью хрящевых концевых панелей. Вместе со смежными позвонками, структура позвонков-IVD образует функциональный блок позвоночника (БСС). Эти микроструктур содержат уникальные типы клеток, а также уникальные внеклеточный матрикс. Всего органной культура БССА сохраняет нативный внеклеточный матрикс, дифференциации клеток фенотипов и клеточно-матрица. Таким образом, методы органной культуры являются особенно полезными для исследования сложных биологических механизмов IVD. Здесь мы описываем с высокой пропускной подход для культивирования весь поясничный пох мыши, которая обеспечивает идеальную платформу для изучения механизмов болезни и терапии для IVD. Кроме того, мы опишем Several приложения, которые используют этот метод органной культуры для проведения дальнейших исследований, включая контрастированием microCT визуализации и трехмерного высокого разрешения моделирования конечных элементов в IVD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Боль в пояснице (LBP) является ведущим фактором глобальной инвалидности и потери производительности на рабочем месте, и только американцы тратят свыше 50 миллиардов долларов на лечении LBP 1. Хотя распространены, этиология LBP остается сложной и многофакторной. Тем не менее, межпозвоночного диска (IVD) дегенерация является одним из наиболее значимых факторов риска для LBP 2.

IVD состоит из трех микроструктур: внешняя кольцевая фиброз (АФ), внутренние студенистое ядра (НП), и два хрящевых концевых шайб , что сэндвич - вся структура проксимально и дистально 3. Со старением и дегенерацией, компоненты IVD изменить структурно, композиционно, и механически 4. Эти изменения включают в себя потерю протеогликанов и гидратации в НП, уменьшение высоты диска, а также ухудшение механической компетентности 5. Эти изменения являютсячасто сопровождаются цитокин , которые способствуют воспалительную реакцию, а также нейтрофилы и заднекорешкового вторжение ганглия в суставное пространство , кульминации в каскаде событий , которые приводят к появлению симптомов LBP 6.

Изучение механизмов дегенерации МПД является сложной задачей для человека, потому что это часто не представляется возможным, чтобы изолировать причину дегенерации до появления боли в пояснице. Таким образом, редукционистом подход упрощает экспериментальную систему вплоть до IVD органа позволяет механистической тонкую настройку причинных переменных и изучение их вниз по течению 5. Система сводится только к родной популяции клеток и окружающих внеклеточного матрикса, что позволяет прямую интерпретацию воздействия внешних раздражителей на IVD дегенерации. Кроме того, более низкая стоимость и масштабируемость мышиных моделях, а также большое количество генетически модифицированных животных 7, позволяют тон быстрый целевой скрининг дегенеративных механизмов IVD и потенциальных методов лечения. Здесь мы описываем мышиную систему органной культуры, в которой IVD клеточная и тканевая стабильность сохраняется в течение 21 дней, с особым вниманием к данному гомеостазу, механическим, структурным и воспалительным СТРУКТУРАМ IVDs. Используя этот метод, мы контролируем функциональные изменения , которые IVDs' в колотой модели индуцированной травмы 8 , чтобы понять механизмы , лежащие дегенерациями диска. Кроме того, мы опишем несколько применений этого способа культивирования органа для проведения дальнейших исследований, включая контрастированием microCT визуализации и трехмерного моделирования с высокой разрешающей способностью в IVD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Вашингтонского университета в Комитете по изучению животных Сент-Луисе.

1. Животные

  1. Получают два штамма мышей: 10-недельного возраста линии BALB / с (п = 6, BALB-М, BALB / cAnNTac) и 10-недельных ядерного фактора каппа-В-люциферазы репортер животных (NF-κβ-Luc) разводят на BALB / с фоном (п = 6, BALB / с-Тг (Рела-Luc) 31Xen).
  2. До вскрытия, эвтаназии животных с СО 2 передозировки при скорости потока 2,5-3 л / мин в течение 5 мин с последующей дополнительной 2 мин времени задержки.
  3. Дезинфекция вне области животного, промывая его в ванне этанола 70% в течение 2 мин до вскрытия.

2. Препарирование

  1. Делают продольный вертикальный разрез на дорсальной поверхности мыши с помощью небольших рассечение ножницами, чтобы обнажить полость тела.
  2. Сделайте две продольные вертикальные разрезы по обе стороны от позвоночника животного, начиная спервый поясничных позвонков (L1), в хвостовых позвонков (С8).
  3. Используя скальпель, пинцет, мелкие и тонкие рассечение ножницами, осторожно удалить позвоночник от L1-C8 из полости тела животного.
  4. Осторожно удалите избыток мягких тканей, окружающих позвоночник, обеспечивая при этом, чтобы не царапать или повреждать IVD на брюшной стороне.
  5. Далее рассекают позвоночник в позвонках-диска позвонков функциональных спинальных единиц (пох) на L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, С3 / С4 / С5, С6, С7 и / С8 дисков.
  6. Ополосните пох в сбалансированном солевом растворе Хэнка с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина в течение 2 мин.
  7. Случайным назначить пох на три группы: некультурных и необработанной ПОХ (свежие), культивируют, но необработанной ПОХ (контроль), и культивировали и обрабатывали колотой ПОХ (Stab).
  8. Привязка заморозить образцы Свежий БСС с жидким азотом сразу после вскрытия и хранить в морозильной камере C -20 °.

3. Орган Условия культивирования

  1. Подготовьте 500 мл стерильной культуральной среды 1: 1 Дульбекко модифицированная среда Игла: питательная смесь F12 (DMEM: F12) с добавлением 20% бычьей эмбриональной сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина.
  2. Используя 10 мл серологические пипетки, пипетки 2 мл культуральной среды в каждую лунку планшета для культуры 24-луночного.
  3. После вскрытия и промыть, поместить каждую БСС в отдельную лунку в средствах массовой информации заполнены 24-луночного планшета.
  4. Инкубируйте образцы в стерильном инкубаторе , который поддерживает 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 и> влажности 90%.
  5. После начального периода культивирования 24 ч, механически травмировать образцы Стаб групп с помощью прокола фиброзного кольца , используя стерильный 27 калибра иглы , как показано на рисунке 1А.
  6. Изменение среды каждые 48 ч по подготовке нового медиа-заполнены 24-луночный культуральный планшет, и образцы передачи от старой пластины к новым использованием стерильных пинцетов. Аспирируйте старые средства массовой информации и Disposе старой культуры пластины в бункере для биологически опасных отходов.
  7. В последний день культивирования, инкубировать все образцы в среде, содержащей 0,75 мг / мл хлорида нитро синего тетразолия в течение 24 ч.
  8. После этого, заморозить все ПОХ с жидким азотом и хранить в морозильной камере C -20 ° до готовности для механических испытаний или гистологии (Фиг.1В).

4. Продольные измерения NF-кВ

  1. Изображение по ПОХ от NF-Кв-люциферазы животных на 1, 5, 13 и 19 дней, чтобы оценить экспрессию NF-kB.
  2. Добавьте 10 мкл раствора 1 мг / мл люциферин в каждую лунку и инкубируют в стерильном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
  3. Изображение образцов для биолюминесценции с использованием системы формирования изображения с 1 мин времени экспозиции и настройкой бен 2.
  4. Одновременно с этим, использовать машину, чтобы сфотографировать и обложите его биолюминесценцию изображения, чтобы определить анатомическое расположение люминесценции в IVD.
  1. Определить механическое поведение IVDs с помощью перемещения контролируемого динамического сжатия 9.
  2. С помощью микроскопа рассечения, скальпель и пинцет, удалить костные тела позвонков бывшего СССР из каждого образца при сохранении хрящевых концевых шайб целости и прилагаются к IVD.
  3. Приложить изолированный IVDs к алюминиевой пластине в 1 см х 1 см х 0,2 см с использованием цианакрилатный клея.
  4. Измерьте высоту и ширину диска, принимая в среднем трех измерений на продольной оси каждого диска с помощью лазерного микрометра. Рассчитывает соотношение высоты диска путем деления средней высоты диска по максимальной ширине диска.
  5. С помощью измеренной высоты диска для вычисления значений деформации входных используемых в механических испытаниях. Обратите внимание, что средняя высота диска составляла приблизительно 690 мкм ± 39 мкм.
  6. Поместите образцы в фосфатно-солевом буферном ванну под compressiна машине и предварительной загрузки диска до 0,02 N.
  7. Циклический сжать диск с помощью синусоидального сигнала с частотой 1 Гц в течение 20 циклов на уровне деформации 1% и 5% уровня деформации в течение 3 испытаний каждый и записывать значение нагрузки и смещения IVD. Подождите 10 мин времени отдыха между испытаниями для диска, чтобы расслабиться и избежать травм.
  8. Рассчитывают среднюю жесткость от фазы загрузки последнего цикла, и вычислить тангенс потерь от фазового угла между данными нагрузки и перемещения.

6. протеогликан и Коллаген Количественный

  1. После механических испытаний, измерение влажного веса диска путем помещения изолированного IVD в предварительно взвешенной центрифужной пробирке и измерение веса с помощью аналитических весов.
  2. Дайджест выделенных IVDs в 250 мкл раствора папаин пищеварения (0,1 М ацетата натрия, 0,01 М ЭДТА, 0,005 М цистеина HCl, рН 6,4) в течение ночи при 65 ° С с использованием блока нагревателя.
  3. Центрифуга образцы в течение 10 минпри 2000 мкг и собирают надосадочную жидкость.
  4. Измерьте протеогликан содержания IVD с помощью диметилметилена синего (DMMB) анализа со стандартами хондроитинсульфата.
  5. Готовят раствор DMMB (21 мг DMMB, 5 мл абсолютного этанола, 2 г формиата натрия в 1 л DDH 2 O).
  6. Пипетка 30 мкл стандартов и образцов в трех экземплярах в 96-луночный планшет, вместе с 250 мкл раствора DMMB в каждую лунку.
  7. Измерить оптическую плотность пластины при 525 нм с использованием спектрофотометра.
  8. Измерьте содержание коллагена с использованием набора для анализа гидроксипролины в соответствии с инструкциями производителя.

7. гистологии

  1. Закрепить подмножество образцов в 4% параформальдегидом в течение 24 ч, де-отвердевают в 5% -ной муравьиной кислоты в течение 48 ч, обезвоживают с этанолом, и встроить в парафин.
  2. Используя микротом, раздел образцов сагиттального при толщине 10 мкм и применяется к секции стеклам. Пятно секции, используя Safranin-O / Fast Grееп и DAPI.
  3. С помощью светового микроскопа, изображение скользит на 10-кратным увеличением.

8. Контрастное microComputed томография (microCT)

  1. Сканирование подмножества выборок в моменты времени 0, 2, 5 и 7 дней с использованием продольного Ioversol контрастом усиления 10, и концевое фосфорно кислоты (ПМА) контрастированием усиления в момент времени 7 дней.
  2. 4 ч до microCT времени сканирования, добавить 300 мкл 350 мг / мл иода Ioversol раствора в культуральной среде до конечной концентрации приблизительно 50 мг / мл йода раствора, содержащего Ioversol и инкубировать в стерильном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 4 час
  3. После инкубации обернуть образец в стерильной марли и место в микроцентрифужных трубки 1 мл.
  4. Место образцы в системе microCT и сканировать при 45 keVp, 177 мкА, размер мкм вокселей 10,5, и 300 мс интеграции.
  5. Экспорт данных из microCT как DICOM файлов и визуализации с помощью программного обеспечения (
  6. В момент времени 7 дней, исправить образцы с использованием 4% -ного раствора параформальдегида в течение 24 ч, а затем 5% -ным раствором PMA в течение 3 дней, и сканирование с использованием тех же параметров, как те, которые используются на этапе 8.4.

9. Трехмерное моделирование методом конечных элементов

  1. Сегмент в DICOM файлы в IVDs с использованием программного обеспечения с ручным пороговым (например, OsiriX).
  2. Преобразование томов NP и AF на IVD в вокселях на основе конечных элементов с использованием сетки MeshLab.
  3. Объединяют микроструктуры НП и AF, чтобы сформировать полный IVD и применить экспериментально определенные граничные условия в программном обеспечении конечных элементов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Фигуры 2-3 показывают репрезентативные результаты протеогликанов распределения, выражение NF-kB, жесткость, вязкость, высоту диска, и мокрый вес для культивируемого IVDs мыши. Если культивировать правильно, параметры IVD из контрольной группы не должны существенно отличаться от Фреш группы. Если культура заражена или иным образом скомпрометирована, контрольная группа будет отличаться от Фреш группы, особенно в выражении NF-kB и протеогликаны распределения (результаты не показаны). На рисунках 4-5 - шоу применения органной культуры в использовании контрастного усиления microCT , чтобы получить трехмерный модель IVD; кроме того, моделирование конечных элементов может быть применено к этим структурам, чтобы определить распределение напряжений и деформаций ткани из-за глобальное механическое поведение.

Рисунок 1
Рисунок 1. ЭкспериментальныйОбзор. (A) межпозвоночный диск функциональных блоки позвоночника (пох) рассекали от поясничных и каудальных сегментов; ПОХ содержал двух интактных позвонков, хрящевой и концевых шайб межпозвоночного диска. (В) После вскрытия, образцы были разделены на группы лечения и культивировали в пробирке в течение 21 дней. После этого, подмножество образцов использовали для механических испытаний и биохимических анализов, в то время как другое подмножество образцов использовало для гистологического анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 1
Рисунок 2. гистологии и экспрессия NF-kB. (А) Через 21 дней в культуре, окрашивание Сафранин O (красный) показывает , что содержание протеогликанов поддерживаетсякак в ФП и НП в контрольных образцах. (Б) Stab образцы (прокол сайт показано стрелкой) показал , уменьшилось содержание протеогликанов в обоих AF и NP. (С) тетразолия синего окрашивания (синий) показывает совместную локализацию. (D) , DAPI окрашивание показывает , что клетки являются метаболически активными и жизнеспособными после 21 дней в культуре органов. Выражение (E) NF-kB в обеих контрольных образцах и Stab также показывает , что IVD жизнеспособен и отзывчивый к окружающей среде. Пробивающий образцы повышенной экспрессии NF-кВ в 1, 5, 13, а также пунктах 19-дневные. Поясничные IVDs показаны здесь. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 1
Рисунок 3. Механика и композиции. ( B) Механические испытания показали , что на уровне деформации 1% и 5%, Stab образца жесткости и потери значения касательные ниже по сравнению с контрольными образцами. (C - D) Биохимические анализы показали , что композиционно, Stab образцов имели более низкие протеогликаны и содержание коллагена (нормированное сырой вес) по сравнению с контрольными образцами. - Е) Структурно, Stab образцы имели пониженное соотношение высоты диска и влажный вес по сравнению с контрольной группой . Механически, композиционно и структурно, свежие и контрольных образцов значения существенно не отличались друг от друга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 1
Рисунок 4. Контрастное microCT visualizatион. Контрастное microCT может быть использовано для визуализации IVD в трех измерениях во время периода культивирования. Хвостовой IVDs показаны здесь. Дифференциальное связывание Ioversol к AF (нижние затухания) и NP (выше, затухание) позволяет отличить AF от NP. И наоборот, РМА преимущественно связывается с коллагеновых остатков в ФП (выше, затухание), концевых шайб и хорды. Изображения были визуализированы с помощью цвета таким образом, что белый представляет высокое затухание, желтый представляет собой среднюю затухание, и красный представляет малое затухание. - Е) Сагиттальный вид на IVD в дни 0, 2, 5 и 7 с контрастированием Ioversol, так и с PMA контраста. (F - J) Поперечный вид на IVD в дни 0, 2, 5 и 6 с контрастом Ioversol, так и с PMA контрастом. Хвостовой IVDs показаны здесь. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть лиrger версия этой фигуры.

Рисунок 1
Рисунок 5. Моделирование методом конечных элементов (МКЭ) структуры IVD. FEM анализ представляет собой мощный математический инструмент, который позволяет вычисление локального отклика материала на большие граничных условия. Например, (А) НП может быть вынесено отдельно от (B) АФ, и каждый отсек может быть присвоен уникальный конститутивные свойства. (С) Комбинированной структурой IVD как с AF и NP показана в 3D. Когда осевые нагрузки приложены к диску на верхней концевой пластине с нижней концевой пластинкой является фиксированным краем, мы можем определить локальные концентрации напряжений и деформаций. Желтые точки и черные стрелки представляют узловая нагрузка применяется. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотраБольшая версия этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол очерчивает органную культуру мышиного БССА с акцентом на мониторинг биологических изменений в IVD. Успешное содержание этих культур требует тщательной стерильной техники. В частности, рассечение шаги 2,1-2,6 и культура шаги 3,1-3,6 требуют особого ухода, чтобы обеспечить стерильные условия поддерживаются, и эти шаги должны быть выполнены предпочтительно в изолированной комнате с процедурой НЕРА воздушного потока, чтобы свести к минимуму примеси. Поскольку процесс рассечения вызывает травму тканей, 24-часовой период прекондиционирования в 3.5 требуется для всех групп лечения, включая контроль. Жизнеспособность анализы могут быть использованы для обеспечения образцы живы и незагрязненные, а также служить в качестве подтверждения, что клеточный гомеостаз поддерживается. Показания люминесценции NF-кВ, также могут быть использованы для мониторинга в продольном направлении воспалительной реакции культивируемых ПОХ; увеличение NF-кВ экспрессион в процессе культивирования может указывать на пох загрязнены или иначе в условиях стресса от инфекции 11, и , таким образом , мы включаем его здесь в качестве возможного шага по устранению неполадок. Наконец, сравнение свежих групп служат в качестве дополнительной контрольной точки для контроля культивируемых образцов в гистологии и механических характеристиках. Эта техника культура поддается нескольких образцов на пластине, и по нашему опыту, до 24 образцов на 24-луночный планшет может быть легко выполнена. Тем не менее, мультиплексирование образцов также распространяется риск перекрестного загрязнения и, таким образом, рекомендуется, чтобы ПОХ можно культивировать на отдельных пластин при устранении неисправностей. Кроме того, в то время как этот протокол обеспечивает инструкции для периода культивирования 21 дней, и тот же метод может быть использован для периодов культуры, которые длиннее или короче. Пох успешно культивировать нашу лабораторию для периодов культуры, начиная от 1 недели до 5 недель.

Lикэ всех моделей, модель органной культуры в мышином имеет ограничение, в частности, в их способности улавливать условия нагружения людей. Есть также тонкие различия в геометрии между мышиным и человеческим IVDs 12, и люди двуногие с главным осевыми нагрузками на позвоночнике в то время как крысы и мыши четвероногие. Однако, поскольку культивируют условие относительно разгружены в его текущей форме, режим загрузки, скорее всего, не повлияли на IVDs. Другие системы , такие как модели культуры бычьего IVD органа 13, 14 может быть лучше подходит для механических и погрузочных взаимодействий. Дальнейшая работа будет включать в себя условие нагрузки для того, чтобы исследовать mechanobiological взаимодействий между механическими и экологическими факторами. Сила этого подхода заключается в его последовательности, универсальности и возможности для изображений с высоким разрешением. Наш подход здесь демонстрирует, что можно культуры бпоясничный и др хвостовые IVDs, но важно отметить , что эти диски анатомически отличаются по старению и развитию 15. Таким образом, наша экспериментальная конструкция рандомизирует поясничную и хвостовые уровни отдельно.

Контрастное microCT позволяют с высоким разрешением, неразрушающий, трехмерную визуализацию IVD. Различные контрастные средства могут быть использованы для выделения различных композиционных аспектов IVD. Показано , здесь использование Ioversol, йод-содержащих не-цитотоксического агента гидрофильного 10 и фосфорно - молибденовой кислоты (PMA), тяжелых металлов , что молекулы коллагена в хелаты аминокислот остатков. Используя эти контрастные агенты, микроструктурные особенности в IVD могут быть выделены и идентифицированы. Ioversol отличает относительную гидратацию тканей IVD, обеспечивая тем самым контраст между богатой водой студенистого ядра и менее гидратированного фиброзного кольца.РМА предусматривает дифференциацию относительного состава коллагена в тканях и выделить торцевые пластины, фиброзного кольца и хорды. Ioversol может быть использован в процессе культивирования для определения продольных изменений в гидратации, в то время как РМА может быть применена к IVD в конечной точке культуры для мониторинга изменений коллагена.

Будущие приложения этой технологии включают в себя использование других штаммов трансгенного и нокаутного мышей, чтобы понять различные аспекты IVD дегенерации в других заболеваниях. Кроме того, он является потенциальной платформой для совместной культуры с другими системами органов и клетками, такие как ганглии задних корешков выявления взаимодействий, которые могут способствовать IVD дегенерации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы этой рукописи заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Университета Musculoskeletal исследовательского центра в Вашингтоне (NIH P30 AR057235), молекулярной визуализации Центр (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Грант (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 и NIH K01AR069116. Авторы хотели бы поблагодарить Патрик Вонг за его вклад в сбор данных.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Midwest Scientific TP92096 Used for biochemical assays
24 well plate Midwest Scientific TP92024 Used for organ culture
25 mL pipettes Midwest Scientific TP94024 Used for organ culture
10 mL pipettes Midwest Scientific TP94010 Used for organ culture
5 mL pipettes Midwest Scientific TP94005 Used for organ culture
500 mL bottle top filters, 22 µm Midwest Scientific TP99505 Used for filter media
10 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140098 Used for biochemical assays
200 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140900 Used for biochemical assays
1,000 µL pipette tips Midwest Scientific NP89140920 Used for biochemical assays
DMEM/F-12 Invitrogen 11330032 Used for culture media
Optiray 350 Guebert 19133341 Used for contrast enhanced microCT
Fetal Bovine Serum Sigma F2442 Used for culture media
Penicillin Streptomycin  Sigma P4333 Used for culture media
Tetrazolium Blue Chloride Sigma T4375 Used for biochemical assays
D-Luciferin Sigma L6152 Used for bioluminescence imaging
Chondroitin Sulfate Sigma C9819 Used for biochemical assays
10% Phosphomolybdic Acid Solution Sigma HT152 Used for contrast enhanced microCT
Safranin O Sigma S8884 diluted to .1% concentration (in water)
Fast Green FCF Sigma F7258 .001% concentration
Papain from papaya latex Sigma  P3125 Used for biochemical assays
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleic acid staining
Cyanoacrylate Glue Loctite 234790 Adhesive 
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fischer Scientific S348903 Used for biochemical assays
Big Equipment
BioDent ActiveLife For mechanical testing
Cytation 5 Biotek Spectrophotometer
AxioCam503 Carl Zeiss AG Microscope
VivaCT40 Scanco MicroCT
Analytical balance Denver Instrument Company A-200DS Analytical balance
Incubator HERAcell 150i Thermo Scientific Organ Culture
Dissection Scope VistaVision Used during dissection
Laser Micrometer Keyence LK-081 Measuring disc height
Microcentrifuge 5810 R Eppendorf Used for biochemical assays
Microtome Leica  RM2255 Used for histology
Software
Prism 7 GraphPad For statistics
MATLAB R2014a Mathworks For modeling
Osiri-LXIV Pixmeo Open Source
MeshLab v1.3.3 Visual Computing Lab - ISTI - CNR Open Source
PreView/FEBio 2.3 Utah MRL & Columbia MBL Open Source
ImageJ NIH
Microsoft Excel Windows
Dissection Tools
Cohan-Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools   15000-02 Or any nice pair of spring scissors
Fine Scissors - Sharp  (small) Fine Science Tools   14060-09
Fine Scissors - Sharp  (larger) Fine Science Tools   14060-11
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools   11252-40 At least 2; can also use #3 
Extra Fine Graefe Forceps, serrated Fine Science Tools   11150-10 At least 2
Micro-Adson Forceps, serrated World Precision Instruments 503719-12
Micro-Adson Forceps, teeth World Precision Instruments 501244
Scalpel Handle - #3 Fine Science Tools   10003-12
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools   10004-13
Scalpel Blades - #23 Fine Science Tools   10023-00
Insect Pins, size 000 Fine Science Tools 26000-25
27 G Needle BD PrecisionGlide Needles BD305109

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8, (1), 8-20 (2008).
  2. Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5, (6), 1-48 (2003).
  3. Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13, (3), 131-142 (1995).
  4. Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20, (24), 2690-2701 (1995).
  5. Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34, (8), 1431-1438 (2016).
  6. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15, (6), 1347-1355 (2015).
  7. Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9, (12), (2014).
  8. Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15, (4), 404-413 (2011).
  9. Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48, (10), 2189-2194 (2015).
  10. Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
  11. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9, (11), 778-788 (2009).
  12. O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32, (3), 328-333 (2007).
  13. Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
  14. Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
  15. Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116, (12), (2014).
<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).More

Liu, J. W., Lin, K. H., Weber, C., Bhalla, S., Kelso, S., Wang, K., Tang, S. Y. An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc. J. Vis. Exp. (122), e55437, doi:10.3791/55437 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter