Her præsenterer vi en procedure til udførelse af storskala Ca 2+ -billeddannelse med cellulær opløsning på tværs af flere kortikale lag i frit bevægelige mus. Hundredvis af aktive celler kan observeres samtidigt ved hjælp af et miniature, hovedmonteret mikroskop kombineret med en implanteret prisme probe.
In vivo kredsløb og cellulært niveau funktionel billeddannelse er et kritisk redskab til at forstå hjernen i aktion. Højopløsningsbilleddannelse af musekortiske neuroner med tofotonmikroskopi har givet enestående indsigt i kortikal struktur, funktion og plasticitet. Disse undersøgelser er imidlertid begrænset til hoved faste dyr, hvilket reducerer den adfærdsmæssige kompleksitet, der er til rådighed til undersøgelse. I dette papir beskriver vi en procedure til udførelse af kronisk fluorescensmikroskopi med cellulær opløsning på tværs af flere kortikale lag i frie opførende mus. Vi brugte et integreret miniaturiseret fluorescensmikroskop parret med en implanteret prisme-probe til samtidig visualisering og registrering af calciumdynamikken hos hundredvis af neuroner på tværs af flere lag af den somatosensoriske cortex, idet musen forlovede en ny objektudforskningsopgave i flere dage. Denne teknik kan tilpasses til andre hjerneområder i forskellige dyrearter til andre adfærdsmæssige paradigms.
Cortex er en vigtig spiller i mange komplekse mentale og adfærdsmæssige funktioner, fra opmærksomhed, sensorisk opfattelse og top-down kognitiv kontrol 1 , 2 , 3 til motiverende, belønning og afhængighedsveje 4 , 5 . At forstå de beregningsmæssige processer, der ligger til grund for dens funktion, er et vigtigt mål at opnå en bedre klinisk forståelse af mange mentale og adfærdsmæssige lidelser.
Mange aktuelle teorier om psykiatrisk sygdom drejer sig om ideen om, at kortikale neurale kredsløbsforstyrrelser eller diskoordination kan understøtte kognitive og adfærdsmæssige abnormiteter, der er kendetegnene for tilstande som skizofreni 6 , autisme 7 eller obsessiv-kompulsiv lidelse 8 . Således opnår man niveau for neurale aktivitetsdata fra coRtiske kredsløb inden for den rette sammenhæng med samtidige adfærdsmæssige oplysninger er af stor betydning og kan ideelt set målrettes mod specifikke celletyper til finere neuralkredsløshed.
Miniaturiserede mikroskoper i forbindelse med implanterbare gradientbrydningsindeks (GRIN) mikrolenser muliggør optisk adgang til neuronelle ensembler under frit bevægelige betingelser fra en mangfoldighed af mulige hjernegrupper 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inklusiv cortex 14 , 15 , 16 . Anvendelse af et mobilt mikroskopisystem kombineret med genetisk kodede calciumindikatorer muliggør konsistent billeddannelse af den samme cellulære population, der omfatter hundreder af neuroner i løbet af dage til uger i mange hjerneområder 9 og kan væreGenetisk målrettet mod specifikke celletyper ved anvendelse af viral vektor eller transgene teknikker.
Da cortex er kendt for at understøtte forskellige funktioner og forbinde til forskellige hjerneområder afhængigt af placeringen af cellerne i den corticale lamina 17 , 18 , 19 , er vi interesserede i at opnå samtidig multilags neural aktivitet i våde, opfører fag. Her viser vi, hvordan man billediserer hundredvis af fluorescensmærkede neuroner i frit opførende mus i løbet af dage ved brug af det miniaturiserede fluorescensmikroskop 20 parret med en implanteret prisme probe, som giver et flertalsbillede af cortexen ( figur 1 ).
Prismåben anvendt her består af to separate GRIN-objektiver: et prisme og et cylindrisk relæobjektiv ( Figur 1 ). Lyset fra mikroskopet spænder fluorescensmærkningenCeller placeret langs billedprofilens billedflade, efter at de er reflekteret ud fra hypotenussen af prismedelen af sonden. Det udsendte lys fra cellerne afspejler også ud fra prismehypotenusen, opsamles gennem mikroskopets mål og når sensoren i mikroskopet. Den prisme sonde, der anvendes i denne procedure, er tilpasset til nem brug med standard stereotaxisk udstyr.
Det miniaturiserede fluorescensmikroskop 20 detekterer actionpotentiale-fremkaldte Ca2 + -transienter i neuronpopulationer med enkeltcelleopløsning, efter at disse celler er blevet specifikt mærket med Ca2 + -følsomme genetisk kodede fluorescerende indikatorer. I denne protokol injicerer vi Ca 2+ -indikator kodet i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implanterer en prisme sonde, installerer mikroskopet og dernæst opnår flere dage somatosensoriske (S1-bakben) neurale aktivitetsdata Fra et dyr udsættesD til nye objektoverflader under fri udforskning ( figur 2 ).
Forståelse af neuralt kredsløbsaktivitet under vågen adfærd er et vigtigt niveau af neurovidenskabelig undersøgelse, der er nødvendig for effektivt at dissekere hjernens funktion i sundhed og sygdom. Cortex er en særlig vigtig region at studere i forbindelse med vågen opførsel, da den spiller en vigtig rolle i mange vitale sensoriske, kognitive og udøvende funktioner 28 , 29 .
Den kortikale søjle antages at være den grundlæggende funktionelle enhed i cortexen, og populationsniveauaktiviteten af corticalceller er kendt for at variere baseret på deres fysiske placering i søjlen. Eksempelvis ekspiratoriske neuroner i lag 2/3 i den somatosensoriske cortex projekterer primært til andre neokortiske regioner og modulerer andre kortikale netværk 30 , mens celler i dybere lag primært rammer subkortale områder som thalamus 31 . Optagelse af aktiviteten af hundredeS af forudbestemte corticalceller samtidig og pålideligt over tid på tværs af forskellige laminer i fritt optrængende emner vil i høj grad fremme vores forståelse af cortical informationsstrøm, hvilket muliggør en finere funktionel dissektion af cortikale søjler informeret af realtids adfærdsmæssige oplysninger og opgaverelevant tids- skalaer.
Indsamling af dette niveau af neurale kredsløbsdata er muliggjort ved brug af en effektiv og strømlinet miniaturiseret mikroskopiplatform til at gennemføre storskaleret Ca 2+ -billeddannelse i frit opførende emner (eller hovedfokuserede emner som ønsket). Anvendes med genetisk kodede calciumindikatorer til at muliggøre specifik målretning af celletype og billeddannelse af et flerlags synsfelt tilvejebragt af en kronologisk implanteret prisme-probe, undersøgte denne protokol én sag blandt mange mulige anvendelser: observering af laminære forskelle i somatosensorisk kortikal behandling, når mus Fysisk engageret med en ny genstand ( figur 5 ).Dette er den første proceduremæssige illustration af denne type celle-type specifik, in vivo tilgang til at studere flere kortikale lag i våde, fritt opfølgende dyr og udvider spektret af forsøgsmetoder til rådighed for at forstå laminære strukturer i den aktive hjerne.
Det periskopiske synsfelt aktiveret af prisme sonden i denne teknik kan med fordel anvendes på andre hjernestrukturer, når bevaring af vævet direkte dorsalt til en region af interesse er ønsket; For eksempel kan CA3 billeddannelse opnås uden forstyrrelse af hippocampal funktion.
Prismatsbaseret tilgang til billeddannelse Ca 2+ aktivitet kræver fysisk indsættelse og permanent implantation af en mikroprism i cortexen, hvilket svarer til dannelsen af en kortikal læsion, hvor linsensonden er indsat. Dette kan resultere i forstyrrelser af det lokale neurale kredsløb, herunder afbrydelse af apikale dendritter og processer. THans procedure vil også forårsage en initial aktivering af glialceller i regionen, selv om dette forventes at være lokaliseret til vævet omkring 150 μm fra prismatfladen og at aftage efter at hjernen har helet 22 . Det er meget vigtigt at overveje, om denne teknik vil påvirke dyrets normale kredsløbsanatomi og / eller opførsel ved planlægning af forsøg. Adfærdskontrolgrupper bør altid udføres for at sikre, at der ikke er nogen signifikante ændringer i baseline-adfærd, der kan forårsage forvirrende eksperimentelle resultater.
Ved hjælp af denne miniaturiserede mobile Ca 2+ -billedteknik med neurofarmakologisk manipulation kan forskellige kognitive, sociale, motoriske eller indre adfærdsmæssige paradigmer kombineres med andre fysiologiske målinger uddybe og berige studier, der fokuserer på at forstå neurale kredsløbs funktionelle roller i adfærd og signal Behandling 32 . Suppression eller aktivAtion af bestemte veje moduleret af lægemidler kan påvirke tilknyttede adfærd, som let kan undersøges ved hjælp af denne teknologi 33 . Forgrening i forskellige celletyper ved at ændre målretningen for calciumindikatoren er en anden kraftfuld og nyttig applikation og muliggør mange kreative kombinationer af eksperimentelle værktøjer til at behandle forskellige neurale kredsløbsspørgsmål.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger og K. Svoboda fra Genie-projektet (Genie-Encoded Neuronal Indicator and Effector) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute for deres generøse donation af AAV1-GCaMP6f Til University of Pennsylvania Vector Core. De vil også gerne takke A. Olson og Neuroscience Microscopy Core ved Stanford University støttet af NIH NS069375 tilskud til deres konfokale mikroskopi tjenester.
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6mm diameter) – 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
Heating Pad 5 X 12.5cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
NanoFil 10μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
Omnidrill35, 115-230V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |