यहां, हम बड़े पैमाने पर सीए 2 + इमेजिंग को सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन के साथ-साथ चूहों को स्वतंत्र रूप से चलने में कई कॉर्टिकल परतों में पेश करने की प्रक्रिया पेश करते हैं। सैकड़ों सक्रिय कोशिकाओं को एक लघु, सिर-घुड़सवार माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक साथ देखा जा सकता है जो एक प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच से जुड़ा होता है।
विवो सर्किट और सेलुलर लेयर फंक्शनल इमेजिंग में क्रिया में मस्तिष्क को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण टूल है। दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ माउस कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के उच्च संकल्प इमेजिंग ने कॉर्टिकल संरचना, फ़ंक्शन और प्लास्टिसिटी में अनूठी अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, अध्ययनों के लिए उपलब्ध व्यवहार जटिलता को बहुत कम करने से इन अध्ययनों में निश्चित जानवरों के लिए सीमित है। इस पत्र में, हम चूहों को आज़ादी से व्यवहार करते हुए कई काउटेकल परतों में सेलुलर-रिज़ॉल के साथ पुरानी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम एक एकीकृत लघुकृत प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करते थे जो एक प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के साथ मिलकर कई दिनों में एक उपन्यास वस्तु अन्वेषण कार्य में लगे माउस के रूप में सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स के कई परतों पर सैकड़ों न्यूरॉन्स की कैल्शियम गतिशीलता को एक साथ कल्पना और रिकॉर्ड करते हैं। इस तकनीक को अन्य व्यवहारिक पी के लिए विभिन्न जानवरों के अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में अनुकूलित किया जा सकता हैaradigms।
प्रेरक, इनाम, और व्यसन के मार्ग 4 , 5 से ध्यान देने योग्य, संवेदी धारणा और शीर्ष-नीचे संज्ञानात्मक नियंत्रण 1 , 2 , 3 से कई जटिल मानसिक और व्यवहारिक कार्यों में प्रांतस्था एक आवश्यक खिलाड़ी है। कई मानसिक और व्यवहार संबंधी विकारों की बेहतर नैदानिक समझ विकसित करने के लिए कम्प्यूटेशनल प्रक्रियाओं को समझना एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है।
मनोचिकित्सक रोग केंद्र के कई मौजूदा सिद्धांतों में यह माना जाता है कि कॉर्टिकल न्यूरल सर्किट डिसफंक्शन या डिस्कोडेंशन में संज्ञानात्मक और व्यवहारिक असामान्यताएं आ सकती हैं जो कि सिज़ोफ्रेनिया 6 , ऑटिज्म 7 या जुनूनी-बाध्यकारी विकार 8 जैसी स्थितियों की पहचान हैं। इस प्रकार, सह से जनसंख्या स्तर की न्यूरल गतिविधि डेटा प्राप्त करनाएक साथ व्यवहार संबंधी जानकारी के उचित संदर्भ के भीतर rtical सर्किट बहुत महत्वपूर्ण है, और आदर्श रूप से विशिष्ट तंत्रिका सर्किट विच्छेदन के लिए विशिष्ट सेल प्रकारों पर लक्षित किया जा सकता है।
Implantable ढाल अपवर्तक इंडेक्स (जीआरआईएन) के साथ संयोजन में सूक्ष्मदर्शी सूक्ष्मदर्शी प्रांतस्था 14 , 15 , 16 सहित संभव मस्तिष्क क्षेत्रों 9 , 10 , 11 , 12 , 13 की विविधता से स्वतंत्र रूप से चलती परिस्थितियों के तहत न्यूरॉनल ensembles के लिए ऑप्टिकल पहुंच सक्षम है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों के साथ मिलकर एक मोबाइल माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करके एक ही सेलुलर आबादी के लगातार इमेजिंग की अनुमति मिलती है जिसमें सैकड़ों न्यूरॉन्स को कई मस्तिष्क क्षेत्रों में हफ्तों से लेकर सप्ताह तक शामिल किया जा सकता है, और हो सकता हैआनुवंशिक रूप से वायरल वेक्टर या ट्रांसजेनिक तकनीकों का उपयोग कर विशिष्ट सेल प्रकारों पर लक्षित।
जैसे कि कॉर्टेक्स विभिन्न कार्यों का समर्थन करने के लिए जाना जाता है और कॉर्टिकल लैमिना 17 , 18 , 1 9 के भीतर कोशिकाओं के स्थान के आधार पर विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से जुड़ जाता है, हम जागृत विषयों में जागरूकता के साथ-साथ बहु-स्तर की न्यूरल गतिविधि प्राप्त करने में रुचि रखते हैं। यहां हम दिखाते हैं कि प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोप 20 का इस्तेमाल करके प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के साथ, जो कि प्रांतस्था के बहु-परत दृश्य ( चित्रा 1 ) प्रदान करता है, का इस्तेमाल करते हुए, दिन के दौरान स्वतंत्र रूप से चूहों के व्यवहार में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले न्यूरॉन्स की सैकड़ों छवियों को प्रदर्शित करता है।
यहां प्रयोग किए जाने वाले प्रिज्म जांच दो अलग-अलग GRIN लेंस से बना है: एक प्रिज्म और बेलनाकार रिले लेंस ( चित्रा 1 )। माइक्रोस्कोप से प्रकाश ने फ्लोरोसेंटली लेबल को उत्तेजित किया हैजांच के चश्मे के हिस्से के क्यूबेटोन्यूज से परावर्तित होने के बाद, प्रिज्म जांच के इमेजिंग चेहरे के साथ स्थित कोशिकाओं। कोशिकाओं से उत्सर्जित प्रकाश भी चश्मे के क्यूबोटोजन को दर्शाता है, सूक्ष्मदर्शी के उद्देश्य से एकत्र किया जाता है और माइक्रोस्कोप में संवेदक तक पहुंचता है। इस प्रक्रिया में इस्तेमाल की जाने वाली प्रिज्म जांच को मानक स्टीरियोटेक्सिक उपकरण के साथ आसान उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है।
लघु कोशिकीय कोशिका के संकल्प के साथ न्यूरॉनल आबादी में कम-से-कम फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप 20 का पता लगाता है कि कैओ 2 + ट्रैक्टेन्शंस की क्षमता-विकसित सीओ 2 + -संवेदनशील आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ लेबल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम सीए 2 + इंडिकेटर को वायरल वेक्टर (एएवी 1। सीएएमकेआईएजीसीसीएमपी 6 एफ.पी.ई.एफ.40) में एन्कोडेड करते हैं, एक प्रिज्म जांच बिछाते हैं, सूक्ष्मदर्शी स्थापित करते हैं, और तब सोमाटोसेंसरी (एस 1 हिंद अंग) तंत्रिका गतिविधि डेटा एक जानवर से बेनकाबमुक्त अन्वेषण ( चित्रा 2 ) के दौरान उपन्यास वस्तु सतहों के लिए डी।
जागरूकता के दौरान तंत्रिका सर्किट गतिविधि को समझना स्वास्थ्य और बीमारी में मस्तिष्क समारोह का प्रभावी ढंग से विश्लेषण करने के लिए तंत्रिका विज्ञान संबंधी जांच का एक महत्वपूर्ण स्तर है। कांटेक्स जागरूकता के संदर्भ में अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण क्षेत्र है, क्योंकि यह कई महत्वपूर्ण संवेदी, संज्ञानात्मक और कार्यकारी कार्यों 28 , 2 9 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
कोर्टेक्स में कॉर्टिकल कॉलम को मूल कार्यात्मक इकाई माना जाता है और कॉर्टिकल कोशिकाओं की आबादी-स्तरीय गतिविधि कॉलम के भीतर उनके भौतिक स्थान के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, 2/3 में परतों में उत्तेजक न्यूरॉन्स मुख्य रूप से अन्य नियोक्लास्टिक क्षेत्रों में स्थित है और अन्य कॉर्टिकल नेटवर्क 30 को व्यवस्थित करता है, जबकि गहरे परतों में कोशिकाओं को मुख्य रूप से थैलेमस 31 जैसे उप-क्षेत्रीय क्षेत्रों में प्रोजेक्ट किया जाता है। सौ की गतिविधि रिकॉर्डिंगपूर्व-निर्दिष्ट कॉर्टिकल कोशिकाओं के साथ-साथ स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले विषयों में अलग-अलग लैमीनाओं में समय-समय पर बहुत सीक्रेटिकल सूचना प्रवाह की हमारी समझ को आगे बढ़ाएगा, जिससे वास्तविक समय व्यवहार संबंधी जानकारी और कार्य प्रासंगिक समय-समय पर सूचित किए जाने वाले कॉर्टिकल कॉलम के बेहतर कार्यात्मक विच्छेदन की अनुमति होगी- तराजू।
तंत्रिका सर्किट डेटा के इस स्तर को इकट्ठा करना एक कुशल और सुव्यवस्थित लघु सूक्ष्मदर्शी मंच के उपयोग के साथ-साथ बड़े पैमाने पर सीए 2+ इमेजिंग को स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले विषयों (या वांछित सिर-फिक्स्ड विषयों) में संचालित करने में संभव है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों द्वारा सेल-प्रकार के विशिष्ट लक्ष्यीकरण को सक्षम करने के लिए और एक दीर्घ-प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच द्वारा उपलब्ध कराए गए बहु-परत क्षेत्र को इमेजिंग करने के लिए प्रयुक्त किया गया, इस प्रोटोकॉल ने कई संभावित अनुप्रयोगों में एक मामला का पता लगाया: सोमाटोसेंसरी कॉर्टिकल प्रोसेसिंग में लामिना का अंतर देखकर जब चूहों भौतिक रूप से एक उपन्यास वस्तु ( चित्रा 5 ) के साथ जुड़ा हुआ है।यह इस प्रकार की कोशिका-प्रकार विशिष्ट का पहला प्रक्रियात्मक उदाहरण है, जो सक्रिय रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों को जागृत करने के लिए कई प्रकार की परतों का अध्ययन करने और सक्रिय मस्तिष्क में लामिना संरचनाओं को समझने के लिए उपलब्ध प्रयोगात्मक विधियों के स्पेक्ट्रम को विस्तृत करने के लिए विवो दृष्टिकोण में है।
इस तकनीक में चश्मे जांच द्वारा सक्षम दृश्य के पेरिस्कोपिक फ़ील्ड को अन्य मस्तिष्क संरचनाओं पर लागू किया जा सकता है, जब ऊतक को सीधे बोर के क्षेत्र में सीधे पृष्ठीय के संरक्षण की आवश्यकता होती है; उदाहरण के लिए, सीए 3 इमेजिंग हिप्पोकैम्पल फ़ंक्शन के विघटन के बिना हासिल की जा सकती है।
इमेजिंग सीए -2 + इमेजिंग के लिए प्रिज्म जांच आधारित दृष्टिकोण को कोर्टेक्स में एक माइक्रोप्रिज्म के भौतिक सम्मिलन और स्थायी आरोपण की आवश्यकता होती है, जो एक कॉर्टिकल घाव के निर्माण के समान है जहां लेंस जांच डाली जाती है। इसके परिणामस्वरूप स्थानीय तंत्रिका सर्किट में बाधा उत्पन्न हो सकती है, जिसमें एपिकल डेन्ड्रैक्ट्स और प्रोसेस की रोकथाम भी शामिल है। टीउसकी प्रक्रिया क्षेत्र में ग्लिअल कोशिकाओं की एक प्रारंभिक सक्रियण भी पैदा करेगी, हालांकि यह उम्मीद है कि यह चश्मे के चेहरे से ऊतक को 150 माइक्रोन के स्थान पर स्थानांतरित करने के लिए और मस्तिष्क 22 को ठीक करने के बाद कम हो जाएगा। यह विचार करना बेहद जरूरी है कि प्रयोग की योजना बनाते समय यह तकनीक सामान्य सर्किट शरीर रचना और / या जानवरों के व्यवहार को प्रभावित करेगी। व्यवहार नियंत्रण समूहों को हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए कि आधारभूत व्यवहारों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हैं जो भ्रामक प्रयोगात्मक परिणामों का उत्पादन कर सकते हैं।
न्यूरोफर्माकोलॉजिकल हेरफेर, विभिन्न संज्ञानात्मक, सामाजिक, मोटर या आंतरिक व्यवहार के मानदंडों के साथ इस लघुकृत मोबाइल सीए 2 + इमेजिंग तकनीक का उपयोग करना, और इसे अन्य शारीरिक मेट्रिक्स के साथ जोड़ना व्यवहार और सिग्नल में तंत्रिका सर्किट की कार्यात्मक भूमिकाओं को समझने पर केंद्रित अध्ययन को गहरा और समृद्ध कर सकता है प्रसंस्करण 32 दमन या सक्रियड्रग्स द्वारा नियंत्रित कुछ रास्तेों के व्यवहार से संबंधित व्यवहार को प्रभावित किया जा सकता है, जिसे आसानी से इस तकनीक का उपयोग करके 33 हो सकता है । कैल्शियम सूचक के लक्ष्यीकरण को संशोधित करके विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में बांटना एक और शक्तिशाली और उपयोगी अनुप्रयोग है, और विभिन्न तंत्रिका सर्किट प्रश्नों को संबोधित करने के लिए प्रयोगात्मक टूल के कई रचनात्मक संयोजनों को सक्षम करता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक AAV1-GCaMP6f के अपने उदार दान के लिए हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के जनेलिया रिसर्च कैम्पस में जेनेटिक-एन्कोडेड न्यूरॉनल इंडिकेटर और एफ़ाक्कोटर (जेनआईई) प्रोजेक्ट से वी। जयरामन, डीएस किम, एलएल लोगर और के। सेवोबोडा को धन्यवाद देना चाहते हैं। पेन्सिलवेनिया वेक्टर कोर विश्वविद्यालय के लिए वे स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी में ए। ओल्सन और न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर का धन्यवाद करना चाहते हैं, जो उनकी confocal माइक्रोस्कोपी सेवाओं के लिए एनआईएच एनएस069375 अनुदान द्वारा समर्थित हैं।
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6mm diameter) – 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
Heating Pad 5 X 12.5cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
NanoFil 10μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
Omnidrill35, 115-230V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |