Här presenterar vi ett förfarande för att utföra storskalig Ca 2+ -bildning med cellulär upplösning över flera kortikala skikt i fritt rörliga möss. Hundratals aktiva celler kan observeras samtidigt med ett miniatyr, huvudmonterat mikroskop kopplat till en implanterad prisma sond.
In vivo krets och cellulär nivå funktionell bildbehandling är ett viktigt verktyg för att förstå hjärnan i handling. Högupplösningsavbildning av muscortikala neuroner med tvåfotonmikroskopi har gett unika insikter i kortikal struktur, funktion och plasticitet. Dessa studier är dock begränsade till att fasta fasta djur, vilket avsevärt minskar den beteendemässiga komplexiteten som är tillgänglig för studier. I detta dokument beskriver vi ett förfarande för att utföra kronisk fluorescensmikroskopi med cellulär upplösning över flera kortikala skikt hos frilövande möss. Vi använde ett integrerat miniatyriserat fluorescensmikroskop parat med en implanterad prisma sond för att samtidigt visualisera och registrera kalciumdynamiken hos hundratals neuroner över flera lager av den somatosensoriska cortexen som musen förlovat i en ny objektutforskningsuppgift, över flera dagar. Denna teknik kan anpassas till andra hjärnregioner i olika djurarter för andra beteendepatienteraradigms.
Cortexen är en viktig aktör i många komplexa mentala och beteendemässiga funktioner, från uppmärksamhet, sensorisk uppfattning och top-down kognitiv kontroll 1 , 2 , 3 mot motivation, belöning och missbruksvägar 4 , 5 . Att förstå de beräkningsprocesser som ligger till grund för sin funktion är ett viktigt mål att driva en bättre klinisk förståelse för många psykiska och beteendestörningar.
Många aktuella teorier om psykiatrisk sjukdom ligger centralt kring idén om att kortikala neurala kretsdysfunktioner eller diskoordination kan ligga till grund för kognitiva och beteendemässiga abnormiteter som är kännetecken för förhållanden som schizofreni 6 , autism 7 eller tvångssyndrom 8 . Således erhöll man uppgift om neurala aktivitetsdata från populationen från koRtiska kretsar inom det korrekta sammanhanget med samtidig beteendeinformation är av stor betydelse och kan idealiskt riktas mot specifika celltyper för finare neuralt kretsdissektion.
Miniatyriserade mikroskop i samband med implanterbara gradientbrytningsindex (GRIN) mikrolinser möjliggör optisk åtkomst till neuronella ensembler under fritt rörliga förhållanden från en mångfald av möjliga hjärnområden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inkluderande cortex 14 , 15 , 16 . Genom att använda ett mobilmikroskopysystem kopplat till genetiskt kodade kalciumindikatorer möjliggör konsekvent avbildning av samma cellulära population som omfattar hundratals neuroner över dagar till veckor i många hjärnregioner 9 och kan varaGenetiskt riktade mot specifika celltyper med användning av viral vektor eller transgena tekniker.
Eftersom cortex är känt för att stödja olika funktioner och ansluta till olika hjärnregioner beroende på placeringen av cellerna i cortical lamina 17 , 18 , 19 , är vi intresserade av att erhålla simultan flerlags neural aktivitet i vakna uppträdande ämnen. Här visar vi hur man bildar hundratals fluorescensmärkta neuroner i fritt uppträdande möss över dagar, med hjälp av det miniatyriserade fluorescensmikroskopet 20 parat med en implanterad prisma sond, som erbjuder en flerskiktsvy av cortexen ( Figur 1 ).
Prismatsonden som används här består av två separata GRIN-linser: ett prisma och en cylindrisk relälins ( Figur 1 ). Ljuset från mikroskopet exciterar fluorescensmärkningenCeller belägna längs prismatorns bildningsytan, efter att de reflekterats från hypotenusen av probens delprofil. Det emitterade ljuset från cellerna speglar också av prismans hypotenus, samlas in genom mikroskopets mål och når sensorn i mikroskopet. Den prisma sonden som används i denna procedur är anpassad för enkel användning med standard stereotaxisk utrustning.
Det miniatyriserade fluorescensmikroskopet 20 detekterar aktionspotential-framkallade Ca2 + -transienter i neuronpopulationer med enkelcellsupplösning, efter det att dessa celler har märkts specifikt med Ca2 + -sensitiva genetiskt kodade fluorescerande indikatorer. I detta protokoll injicerar vi Ca 2+ -indikatorn kodad i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantera en prisma sond, installera mikroskopet och sedan erhålla flera dagar av neurala aktivitetsdata för SAT-bakbenet Från ett djur exponeraD till nya objektytor under fri utforskning ( Figur 2 ).
Att förstå neuralt kretsaktivitet under vakat beteende är en vital nivå av neurovetenskaplig undersökning som behövs för att effektivt dissekera hjärnans funktion i hälsa och sjukdom. Cortexen är en särskilt viktig region för att studera i samband med vaket beteende, eftersom det spelar en viktig roll i många viktiga sensoriska, kognitiva och verkställande funktioner 28 , 29 .
Den kortikala kolonnen anses vara den grundläggande funktionella enheten i cortex och populationsnivåaktiviteten hos kortikala celler är känd för att skilja sig beroende på deras fysiska placering i kolonnen. Exempelvis sträcker excitatoriska nervceller i skikt 2/3 i den somatosensoriska cortexen primärt till andra neokortiska områden och modulerar andra kortikala nätverk 30 medan celler i djupare skikt främst verkar för subkortiska områden som thalamus 31 . Spela in aktiviteten av hundraS av fördefinierade kortikala celler samtidigt och tillförlitligt över tid över olika laminer hos fritt uppträdande personer skulle avsevärt öka vår förståelse för kortikalt informationsflöde, vilket möjliggör en finare funktionell dissektion av kortikala kolumner informerad av realtids beteendeinformation och uppgiftsrelevant tids- skalor.
Att samla denna nivå av neurala kretsdata är möjlig med hjälp av en effektiv och strömlinjeformad miniatyriserad mikroskopiplattform för att genomföra storskalig Ca 2+ -bildning i fritt uppträdande ämnen (eller huvudfästa ämnen som önskat). Används med genetiskt kodade kalciumindikatorer för att möjliggöra specifikt inriktning av celltyp och avbilda ett flerskiktsfält som tillhandahålls av en kroniskt implanterad prisma sond, undersökte detta protokoll ett fall bland många möjliga tillämpningar: observera laminära skillnader i somatosensorisk kortikal bearbetning när möss Fysiskt förlovad med ett nytt objekt ( figur 5 ).Detta är den första procedurillustrationen av denna typ av celltypsspecifik in vivo-tillvägagångssätt för att studera flera kortikala skikt i vakna, fritt uppförande djur och breddar spektrumet av experimentella metoder som är tillgängliga för att förstå laminära strukturer i den aktiva hjärnan.
Det periskopiska synfältet aktiverat av prismatsonden i denna teknik kan med fördel tillämpas på andra hjärnstrukturer när bevarande av vävnaden direkt dorsal till en region av intresse är önskvärt; Till exempel kan CA3-bildbehandling uppnås utan störning av hippocampalfunktionen.
Prismatsbaserad metod för bildbehandling av Ca2 + -aktivitet kräver fysisk införande och permanent implantering av en mikroprism i cortexen, vilket motsvarar skapandet av en kortikalskada där linsproben sätts in. Detta kan leda till störningar i den lokala neurala kretsen, inklusive avskiljning av apikala dendriter och processer. THans förfarande kommer också att leda till en initial aktivering av glialceller i regionen, fastän detta förväntas lokaliseras till vävnaden ca 150 | im från prismans ansikte och att sänka sig efter att hjärnan har läkt 22 . Det är mycket viktigt att överväga om denna teknik kommer att påverka normala kretsanatomi och / eller beteende hos djuren vid planering av experiment. Behaviorskontrollgrupper bör alltid genomföras för att säkerställa att det inte finns några signifikanta förändringar i baslinjebeteenden som kan ge upphov till förvirrande experimentella resultat.
Användning av denna miniatyriserade mobil Ca 2+ bildteknik med neurofarmakologisk manipulation, olika kognitiva, sociala, motoriska eller inneboende beteendeparadigma och kombinera det med andra fysiologiska mätvärden kan fördjupa och berika studier som är inriktade på att förstå funktionella roller hos neurala kretsar i beteende och signal Bearbetning 32 . Suppression eller aktivAtion av vissa vägar som moduleras av droger kan påverka associerade beteenden, som lätt kan studeras med hjälp av denna teknik 33 . Att förgrena sig till olika celltyper genom att modifiera målningen av kalciumindikatorn är en annan kraftfull och användbar applikation och möjliggör många kreativa kombinationer av experimentella verktyg för att hantera olika neurala kretsfrågor.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger och K. Svoboda från Genie-projektet (Genie-Encoded Neuronal Indicator and Effector) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute för deras generösa donation av AAV1-GCaMP6f Till University of Pennsylvania Vector Core. De skulle också vilja tacka A. Olson och Neuroscience Microscopy Core vid Stanford University med stöd av NIH NS069375 bidrag för sina konfokala mikroskopitjänster.
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6mm diameter) – 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
Heating Pad 5 X 12.5cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
NanoFil 10μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
Omnidrill35, 115-230V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |