Skive patch klemme teknik er en effektiv metode til at analysere læring-inducerede ændringer i iboende egenskaber og plasticitet af excitatoriske eller hæmmende synapser.
Skive patch klemme teknik er et kraftfuldt værktøj til at undersøge læring-induceret neurale plasticitet i specifikke hjerneregioner. For at analysere motor-learning induceret plasticitet, vi er uddannet rotter ved hjælp af en fremskyndet rotor rod opgave. Rotter udført opgaven 10 gange på 30-s intervaller for 1 eller 2 dage. Performance blev væsentligt forbedret uddannelse dage i forhold til den første retssag. Vi forberedte derefter akut hjernen skiver af den primære motor cortex (M1) hos utrænede og trænede rotter. Nuværende-clamp analyse viste dynamiske ændringer i hvile membran potentiale, spike tærskel, afterhyperpolarization og membran modstand i layer II/III pyramideformet neuroner. Nuværende injektion induceret mange flere pigge i 2-dages uddannet rotter end utrænede kontrol.
For at analysere kontekstuel læring induceret plasticitet, vi er uddannet rotter ved hjælp af en hæmmende undgåelse (IA) opgave. Efter at have oplevet mund-chok i den mørke side af en boks, lært rotter at undgå det, opholder sig i det oplyste side. Vi forberedt akut hippocampus udsnit fra utrænede, IA-uddannet, uparrede og walk-through rotter. Spænding-clamp analyse blev brugt til at optage fortløbende miniature excitatoriske og hæmmende postsynaptiske strømme (mEPSCs og mIPSCs) fra den samme CA1 neuron. Vi fandt forskellige gennemsnitlige mEPSC og mIPSC amplituder i hver CA1 neuron, tyder på, at hvert neuron havde forskellige postsynaptiske styrker på sin excitatoriske og hæmmende synapser. Derudover havde sammenlignet med utrænede kontrolelementer, IA-uddannet rotter højere mEPSC og mIPSC amplituder, med bred diversitet. Disse resultater foreslog at kontekstuel læring skaber postsynaptiske mangfoldighed i både excitatoriske og hæmmende synapser på hver CA1 neuron.
AMPA eller GABA-A receptorer syntes at mægle de postsynaptiske strømninger, siden bad behandling med CNQX eller bicuculline en spærret henholdsvis hændelserne mEPSC eller mIPSC. Denne teknik kan bruges til at studere forskellige typer af læring i andre regioner såsom sensorisk cortex og amygdala.
Patch klemme teknik, udviklet af Neher og Sakmann, har været meget anvendt til elektrofysiologiske eksperimenter1. Hele-celle patch klemme teknik2 kan bruges til at registrere intracellulære strøm eller spænding ved hjælp af gigaohm segl af cellemembranen. Nuværende-clamp-teknik gør det muligt for os at analysere forskellene i membranen egenskaber såsom hvilende potentiale, modstand og kapacitans3. Spænding-clamp-teknik gør det muligt for os at analysere læring-induceret synaptisk plasticitet på både excitatoriske og hæmmende synapser.
Den primære motor cortex (M1) er en central region, der er afgørende for at gøre dygtige frivillige bevægelser. Tidligere elektrofysiologiske undersøgelser viste udviklingen af langsigtede potensering (LTP)-gerne plasticitet i layer II/III ophidsende synapser efter dygtige motor uddannelse4. Desuden, i vivo billeddiagnostiske undersøgelser yderligere demonstreret remodellering af M1 dendritiske pigge efter en dygtig nåede opgave5,6. Læring-induceret synaptic og iboende plasticitet har imidlertid ikke været vist i M1 neuroner.
Vi har for nylig rapporteret, at en rotor rod opgave forfremmet dynamiske ændringer i glutamatergic og GABAergic synapser og ændret den iboende plasticitet i M1 layer II/III neuroner7. Her brugte vi skive patch klemme teknik for at undersøge læring-induceret plasticitet. Denne teknik kan også bruges til at undersøge andre typer af erfaring-afhængige plasticitet i andre områder af hjernen. For eksempel sanseindtryk i den tønde cortex kan styrke AMPA receptor-medieret excitatoriske input til layer II/III neuroner8, og cued frygt conditioning styrker excitatoriske indgangene på de laterale amygdala neuroner, der er nødvendige for frygt hukommelse9. Desuden skaber kontekstuel læring mangfoldighed med hensyn til excitatoriske og hæmmende synaptic input til hippocampus CA1 neuroner10,11.
Den største begrænsning af skive patch klemme teknik er optagelse i Skive forberedelse, der ikke måske afspejler, hvad der sker in vivo. Selv om i vivo aktuelle-clamp analyse er mere pålidelige, er det teknisk udfordrende for at få tilstrækkelige data fra bevidste dyr. Da hver pyramide neuron har forskellige cellulære egenskaber, er et passende antal celler nødvendig for korrekt analysere forskelle i neuroner efter træning. Derudover kræver spænding-clamp analyse kontinuerlig behandling med CNQX, APV eller bicuculline for at bestemme arten af de postsynaptiske svar. For at analysere miniature svar fremkaldt af en enkelt vesikel af glutamat eller GABA, er kontinuerlig behandling med tetrodotoxin nødvendig hen til hindre spontan handling potentialer. Selv om den nyligt udviklede multi photon imaging teknik er stærk til at analysere morfologiske ændringer på excitatoriske synapser19, en kombineret patch klemme teknik er nødvendig for at analysere funktionen af synapser i vivo. Det er i øjeblikket ganske vanskeligt at analysere morfologiske ændringer i hæmmende synapser, da mest hæmmende synapser ikke er en pigge. På dette tidspunkt, ville udsnit patch klemme være den mest hensigtsmæssige teknik til at analysere celleegenskaber eller funktioner af excitatoriske/hæmmende synapser i uddannet dyr.
Ved hjælp af strøm-clamp analyse (figur 4), rapporteret vi for nylig motoriske læring-induceret iboende plasticitet i layer II/III neuroner. Specifikt, 1-dags uddannet rotter viste en betydelig nedgang i hvile membran potentiale og en stigning i spike tærskel. 2-dages uddannet rotter viste en betydelig stigning i hvile membran potentiale, som førte til øget ophidselse. Disse resultater foreslog, at der var dynamiske ændringer i den iboende plasticitet af M1 layer II/III neuroner i uddannet rotter. Yderligere spænding-clamp analyse viste en stigning i parret-puls ratio på 1-dags uddannet rotter, tyder på, at der var en forbigående nedgang i den præsynaptiske GABA release sandsynlighed7. Det er derfor muligt at disinhibition fra GABA på laget II/III synapser kan udløse den resulterende læring-induceret plasticitet i M1. Til støtte for dette kræver skive forberedelse af M1 bad behandling med en GABAA receptor blokker til at fremkalde LTP20.
Analyse af miniature postsynaptiske potentialer er en kraftfuld måde at opdage synaptisk plasticitet i IA-uddannet dyr. Sekventiel indspilning af mEPSCs og mIPSCs i en enkelt CA1 neuron giver mulighed for analyse af synaptic excitatoriske/hæmmende styrken af hver enkelte neuron. Siden en enkelt mig, (I) PSC svar tilskrives en enkelt vesikel af glutamat eller GABA, en stigning i mig (jeg) PSC amplitude antyder postsynaptiske styrke. Med mig, (I) PSC analyse fandt individuelle forskelle i styrken af excitatoriske/hæmmende input til hver CA1 neuron (figur 5 c). IA uddannelse klart forfremmet mangfoldighed i synaptisk styrke, men dette blev ikke observeret i andre grupper (tabel 5).
Læring-induceret synaptic mangfoldighed kan analyseres matematisk. Ved at beregne udseende sandsynligheden for hvert punkt, kan data fra hver neuron konverteres til self-entropi (bit) ved hjælp af informationsteori Claude E. Shannon21. Et punkt med høj udseende sandsynlighed (omkring det gennemsnitlige niveau) indikerer lav self-entropi, mens et punkt med meget sjældne sandsynlighed (en afbøjet punkt) angiver høj self-entropi. Sammenlignet med utrænede rotter, self-entropi pr. neuron var klart øget i IA-uddannet rotter men ikke i uparrede eller walk-through rotter22. Denne analyse tyder på, at der var en stigning i intra-CA1 oplysninger efter den kontekstuelle læring.
Skive patch klemme teknik kan også bruges, for cued frygt conditioning undersøgelser i den laterale amygdala9 og sanseoplevelse undersøgelser i tønde cortex8. Desuden, denne teknik kan bruges med forskellige andre teknikker til yderligere undersøgelser. For eksempel, virus-medieret grøn fluorescerende proteiner (NGL)-mærket gen levering teknik kan kombineres med patch klemme teknik til at analysere funktionen af specifikke molekyler. Fokale mikroinjektion af et retrograd tracer kan desuden bruges til at visualisere specifikke neuroner at projektet til et bestemt område. Derefter, ved hjælp af strøm-clamp-teknik, celle-specifikke egenskaber kan analyseres i visualiseret neuroner23. Yderligere, kombinerer to-foton laser scanning mikroskopi med to-foton laser uncaging af glutamat er blevet brugt til at demonstrere rygsøjlen-specifikke vækst og EPSC svar i mus kortikale layer II/III pyramideformet neuroner19. Skive patch klemme teknik er således forbedres ved at kombinere det med romanen kemikalier, gen levering og foto manipulation teknikker.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. pote-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin og Mrs H. Tsurutani for deres tekniske bistand. Dette projekt blev støttet af Grants-in-Aid for unge forskere (H.K. og Y.S.), videnskabelig forskning B (DM), videnskabelig forskning C (DM), og videnskabelige forskning i Innovative områder (DM), fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab, og Teknologi i Japan.
Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection buffer/ artificial CSF |
|||
NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Intracellular solution | |||
K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Drugs in aCSF | |||
2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |