Slice patch clamp tekniken är en effektiv metod för att analysera lärande-inducerade förändringar i inneboende egenskaper och plasticitet av excitatoriska eller hämmande synapser.
Slice patch clamp tekniken är ett kraftfullt verktyg för att undersöka lärande-inducerad neural plasticitet i delar av hjärnan. För att analysera motor-lärande inducerad plasticitet, tränade vi råttor med en accelererad rotor rod uppgift. Råttor utfört uppgiften 10 gånger med 30-s intervall för 1 eller 2 dagar. Prestanda var signifikant bättre på utbildningsdagar jämfört med den första rättegången. Vi förberett sedan akut hjärnskada skivor av primära motoriska cortex (M1) hos otränade och tränade råttor. Aktuellt-clamp analys visade dynamiska förändringar i vila membranpotential, spike tröskel, afterhyperpolarization och membran motstånd i layer II/III pyramidal nervceller. Nuvarande injektion inducerad många fler spikar i 2-dagars utbildade råttor än otränade kontroller.
För att analysera kontextuell-lärande inducerad plasticitet, tränade vi råttor med en hämmande undvikande (IA) uppgift. Efter att ha upplevt fot-chock i den mörka sidan av en låda, råttorna lärt sig att undvika det, bor i den upplysta sidan. Vi förberett akut Hippocampus segment från otränad, IA-utbildade, oparade och genomgång råttor. Spänning-clamp analys användes för att spela sekventiellt in miniatyr retande och hämmande postsynaptiska strömmar (mEPSCs och mIPSCs) från samma CA1 neuron. Vi hittade olika genomsnittliga mEPSC och mIPSC amplituder i varje CA1 neuron, vilket tyder på att varje neuron hade olika postsynaptiska styrkor vid dess retande och hämmande synapser. Dessutom hade jämfört med otränade kontroller, IA-tränade råttor högre mEPSC och mIPSC amplituder, med bred mångfald. Dessa resultat föreslog att kontextuella lärande skapar postsynaptiska mångfald i både retande och hämmande synapser på varje CA1 neuron.
AMPA eller GABAA -receptorer tycktes medla de postsynaptiska strömmarna, sedan bad behandling med CNQX eller bicucullin blockerade de mEPSC eller mIPSC händelserna, respektive. Denna teknik kan användas för att studera olika typer av lärande i andra regioner såsom de sensoriska hjärnbarken och amygdala.
Den patch clamp teknik, utvecklad av Neher och Sakmann Stuttgart, har använts för elektrofysiologiska experiment1. Det hela-cell patch clamp teknik2 kan användas för att registrera intracellulära ström eller spänning använder gigaohm tätning av cellmembranet. Den nuvarande-clamp tekniken tillåter oss att analysera skillnader i membran egenskaper såsom vilande potential, resistans och kapacitans3. Spänning-clamp tekniken tillåter oss att analysera lärande-inducerad synaptisk plasticitet i både retande och hämmande synapser.
Den primära motoriska cortexen (M1) är en central region som är kritiska för att göra skickliga frivilliga rörelser. Tidigare elektrofysiologiska studier visade utvecklingen av långsiktig potentiering (LTP)-gillar plasticitet i layer II/III retande synapser efter skickliga Finmotorisk träning4. Dessutom visat i vivo imaging studier ytterligare ombyggnaden av M1 Dendritutskotten efter en skicklig nå uppgift5,6. Lärande-inducerad synaptic och inneboende plasticitet har dock inte visats i M1 nervceller.
Vi rapporterade nyligen att en rotor rod aktivitet främjas dynamiska förändringar i glutamaterg och GABAergic synapser och förändrad inneboende plasticitet i M1 layer II/III nervceller7. Här använde vi den bit patch clamp tekniken för att undersöka lärande-inducerad plasticitet. Denna teknik kan också användas för att undersöka andra typer av erfarenhet-beroende plasticitet i andra regioner av hjärnan. Till exempel sinnesintryck i fat cortex kan stärka AMPA receptor-medierad excitatoriska inmatning till lager II/III nervceller8och cued rädsla luftkonditionering stärker de excitatoriska ingångarna på den laterala amygdala nervceller, vilket krävs för frukta minne9. Dessutom skapar kontextuella lärande mångfald när det gäller retande och hämmande synaptisk tillförs Hippocampus CA1 nervceller10,11.
Den största begränsningen av slice patch clamp teknik är inspelningen i slice beredning, som inte kanske återspeglar vad som händer i vivo. Även i vivo ström-clamp analys är mer tillförlitlig, det tekniskt svårt för att få tillräckliga uppgifter från medvetna djur. Eftersom varje pyramidal neuron har olika cellulära egenskaper, behövs ett tillräckligt antal celler att korrekt analysera skillnader i nervceller efter träning. Dessutom kräver spänning-clamp analysen kontinuerlig läkemedelsbehandling med CNQX, APV eller bicucullin att avgöra vilken typ av postsynaptiska svaren. För att analysera de miniatyr svar induceras av en enda vesikler glutamat eller GABA, behövs kontinuerlig behandling med tetrodotoxin att blockera spontana handlingspänningar. Även om den nyligen utvecklade flera photon bildteknik är kraftfull för att analysera morfologiska förändringar vid retande synapser19, behövs en kombinerad patch clamp teknik att analysera funktionen av synapser i vivo. Det är för närvarande ganska svårt att analysera morfologiska förändringar vid hämmande synapser, eftersom mest hämmande synapser inte utgör spines. Vid denna tid vore slice patch klämman den lämpligaste tekniken för att analysera Cellegenskaper eller funktioner av excitatoriska/hämmande synapser i utbildad djur.
Använda aktuell-clamp analys (figur 4), rapporterade vi nyligen motoriskt lärande-inducerad inneboende plasticitet i layer II/III nervceller. Specifikt, 1 dag tränade råttor visade en signifikant minskning i vilopuls membranpotential och en ökning av spike tröskeln. 2-dagars utbildade råttorna uppvisade en betydande ökning i vila membranpotentialen som ledde till ökad retbarhet. Dessa resultat tyder på att det var dynamiska förändringar i inneboende plasticitet av M1 layer II/III nervceller i utbildad råttor. Ytterligare spänning-clamp analysen visade en ökning av förhållandet Parade-pulse i 1 dag tränade råttor, vilket tyder på att det fanns en övergående minskning av presynaptiska GABA release sannolikhet7. Det är därför möjligt att avhämning från GABA på lager II/III synapser kan utlösa resulterande lärande-inducerad plasticitet i M1. Till stöd för detta kräver slice beredning av M1 bad behandling med en GABAA -receptorblockerare inducera LTP20.
Analys av miniatyr postsynaptiska potentialer är ett kraftfullt sätt att upptäcka synaptisk plasticitet i IA-tränade djur. Sekventiell inspelning av mEPSCs och mIPSCs i en enda CA1 neuron tillåter analys av varje enskild neuron excitatoriska/hämmande synaptisk styrka. Sedan en enda mig (jag) PSC svar tillskrivs en enda vesikler glutamat eller GABA, en ökning i mig (jag) PSC amplitud antyder postsynaptiska förstärkning. Hjälp mig (jag) PSC analys, hittade vi individuella skillnader i styrka av excitatoriska/hämmande tillförs varje CA1 neuron (figur 5 c). IA utbildning främjas tydligt mångfald i synaptisk styrka, men detta observerats inte i andra grupper (tabell 5).
Lärande-inducerad synaptic mångfald kan analyseras matematiskt. Genom att beräkna utseende sannolikheten för varje punkt, kan data från varje neuron konverteras till self-entropi (bitars) använder information teorin av Claude E. Shannon21. En punkt med hög utseende sannolikheten (runt den genomsnittliga nivån) visar låg self-entropy, medan en punkt med mycket sällsynta sannolikheten (en avvikit punkt) visar hög self-entropi. Jämfört med otränade råttor, self-entropi per neuron var klart ökat i IA-tränade råttor men inte i oparade eller genomgång råttor22. Denna analys tyder på att det var en ökning av intra-CA1 information efter det kontextuella lärandet.
Slice patch clamp tekniken kan också användas för cued rädsla luftkonditionering studier i laterala amygdala9 och sensorisk upplevelse studier i fat cortex8. Dessutom kan denna teknik användas med olika andra tekniker för vidare utredning. Exempelvis virus-medierad grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta gen leverans teknik kan kombineras med patch clamp teknik för att analysera specifika molekyler funktion. Focal Mikroskop av en retrograd tracer kan dessutom användas för att visualisera specifika nervceller projektet till ett visst område. Sedan, med hjälp av ström-clamp teknik, cell-specifika egenskaper kan analyseras i den visualiserade nervceller23. Ytterligare, kombinera två-photon laserskanning mikroskopi med två-photon laser uncaging av glutamat har använts att demonstrera ryggraden-specifika tillväxt och EPSC svaret i musen kortikala layer II/III pyramidal nervceller19. Således, slice patch clamp tekniken förbättras genom att kombinera det med romanen kemikalier, gen leverans och foto manipulation tekniker.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr tass-Min-Thein-Oo, Dr Han-Nicke-Zin och Mrs H. Tsurutani för deras tekniskt bistånd. Projektet stöddes av Grants-in-Aid för unga forskare (Håkanson och Y.S.), vetenskapliga forskning B (D.M.), vetenskapliga forskning C (D.M.) och vetenskaplig forskning i innovativa områden (D.M.), från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap, och Tekniken för Japan.
Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection buffer/ artificial CSF |
|||
NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Intracellular solution | |||
K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Drugs in aCSF | |||
2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |