Denne protokol beskriver trinene til kloning af flere enkelt-guide-RNA'er i en RNA-concatemervektor, som er særlig anvendelig til at skabe multi-gen-knockouts ved hjælp af CRISPR / Cas9-teknologi. Frembringelsen af dobbelt knockouts i tarmorganoider er vist som en mulig anvendelse af denne metode.
CRISPR / Cas9 teknologi har i høj grad forbedret gennemførligheden og hastigheden af tab af funktionsstudier, der er afgørende for forståelsen af genfunktionen. I højere eukaryoter kan paralogøse gener maske en potentiel fænotype ved at kompensere tabet af et gen, hvilket begrænser de informationer, der kan opnås ved genetiske undersøgelser, der baserer sig på enkeltgenstrengninger. Vi har udviklet en roman hurtig kloning metode til guide RNA (gRNA) concatemers for at skabe multi-gen knockouts efter en enkelt transfektion i mus tyndtarmorganoider. Vores strategi gør det muligt for concatemerization af op til fire individuelle gRNA'er i en enkelt vektor ved at udføre en enkelt Golden Gate-shufflingreaktion med annealed gRNA oligos og en foruddesignet retroviral vektor. Dette tillader enten samtidig udfald af op til fire forskellige gener eller øget knockout effektivitet efter målretningen af et gen ved flere gRNA'er. I denne protokol viser vi detaljeretHvordan man effektivt kloner flere gRNA'er i den retrovirale CRISPR-concatemer-vektor og hvordan man opnår høj effektiv elektroporation i tarmorganoider. Som et eksempel viser vi, at samtidig udkobling af to par gener kodende for negative regulatorer af Wnt signalvejen (Axin1 / 2 og Rnf43 / Znrf3) gør intestinale organoider resistente over for tilbagetrækning af vigtige vækstfaktorer.
Omvendt genetik tilgang er en meget anvendt metode til at undersøge funktionen af et gen. Specielt tab af funktionsstudier, hvor forstyrrelse af et gen forårsager fænotypiske ændringer, spiller en central rolle i opbygningen af vores forståelse af biologiske processer. CRISPR / Cas9-metoden repræsenterer den seneste udvikling inden for genomteknologi og har revolutioneret den nuværende praksis med genetik i celler og organismer. Cas9 er en RNA-styret endonuclease, som binder til en specifik DNA-sekvens komplementær til gRNA'et og genererer en dobbeltstrengspause (DSB). Denne DSB rekrutterer DNA-reparationsmaskineri, som i mangel af en DNA-skabelon til homolog rekombination vil re-ligere den skårne DNA-streng via fejlpræget, ikke-homolog end-sammenføjning, hvilket således kan resultere i insertioner eller deletioner af nukleotid (er) Forårsager fremskift mutationer 1 .
Den store lethed og alsidigheden af CRISPR / Cas9 apprOach har gjort det til et yderst attraktivt værktøj til genome-scale knockout skærme med det formål at unraveling ukendte genfunktioner 2 , 3 . Ikke desto mindre er single gen-knockout-fremgangsmåder af begrænset anvendelse, hvis der findes flere paraloger med overflødige funktioner. Ablatering af et enkelt gen kan således ikke være nok til at bestemme funktionen af dette gen givet mulig kompensation ved paraloger, der resulterer i ringe eller ingen fænotypisk ændring 4 . Det er derfor vigtigt at udjævne paraloger parallelt ved at levere flere gRNA-vektorer rettet mod de forskellige paralogøse gener for at overvinde indflydelsen af genetisk kompensation.
For at udvide brugen af CRISPR / Cas9 til paraloggengen-knockout har vi for nylig udviklet en hurtig, en-trins kloningsmetode til kloning af op til fire for-annealed-gRNA'er i en enkelt retroviral vektor 5 . Rygraden, der hedder CRISPR-concatemer, er baseretPå et MSCV retroviralt plasmid indeholdende gentagne gRNA ekspressionskassetter. Hver kassette indeholder to inverterede genkendelsessteder af Type IIS-restriktionsenzymet Bbs I, som kan erstattes irreversibelt med en glødet gRNA-oligo med matchende overhæng ved anvendelse af en Golden Gate-shufflingreaktion i et enkeltrør 6 . Denne kloningsmetode består af gentagne cykler af fordøjelse og ligering, der tillader samtidig montering af flere DNA-fragmenter ved at udnytte de forskellige overhængssekvenser frembragt af Bbs I. Entiteten af dette enzym er for eksempel evnen til at udføre asymmetriske snit uden for dets genkendelse sekvens; Derfor kan hver kassette have en anden sekvens med tilpasset overhængsflankerende Bbs I-kerneområde, og på denne måde kan hver gRNA klones i en specifik position og orientering af concatemervektoren.
Som et principprincip viste vi brugen af denne strategi iMus-intestinale organoider ved samtidig at forstyrre to par af paralog-negative regulatorer af Wnt-banen med en runde elektroporation 5 .
I de sidste par år har mange andre grupper udviklet lignende strategier baseret på flere gRNA ekspressionsvektorer konstrueret ved anvendelse af Golden Gate shuffling 7 for at opnå multi-gen knockout i forskellige model systemer, såsom humane cellelinjer 8 , 9 , zebrafisk 10 og Escherichia coli 11 . I deres protokoller klones først gRNA'er i individuelle mellemvektorer og samles derefter sammen i et slutprodukt. I modsætning hertil er den største fordel ved vores CRISPR-concatemer-strategi, at det er enkelt med et enkelt Bbs I-shuffling-kloningstrin. Ligesom andre gRNA concatemers muliggør vores metode enten den samtidige knockout på op til fireForskellige gener eller øget CRISPR knockout effektivitet efter målretningen af et eller to gener med multiple gRNA'er ( Figur 1 ).
I denne protokol beskriver vi i detaljer hvert trin i generationen af CRISPR-concatemervektorer, fra gRNA-design til Golden Gate-reaktionen og til bekræftelse af vellykket kloning. Vi tilvejebringer også en yderst effektiv protokol til transfektion af CRISPR-concatemers i mus-tarmorganoider ved elektroporation og efterfølgende vækstfaktor tilbagetrækningsforsøg.
I denne protokol beskriver vi alle de trin, der er nødvendige for at generere CRISPR-concatemers og at anvende CRISPR-concatemers i musedarmorganoider for samtidig at slå flere gener ud. Som tidligere nævnt har denne strategi flere fordele, såsom hastighed, høj effektivitet og omkostningseffektivitet.
For at kunne gennemføre hele proceduren er der et par kritiske aspekter at overveje. For det første er det afgørende, at alle gRNA-oligos er korrekt annealeret og phosphoryleret, da de repræsenterer udgangsmaterialet til Bbs I-kloningsreaktionen, der i sig selv er meget effektivt. For det andet, når de elektroporerende organoider, jo flere celler der anvendes pr. Tilstand, jo højere er den maksimale mulige transfektionseffektivitet. Derudover er det også vigtigt, at celleklynger efter celledissociation dominerer over enkeltceller.
Ikke desto mindre er det muligt at støde på teknisk probLems når man prøver enten kloning eller transfektion for første gang; I tilfælde af problemer under gRNA-kloning anbefales det at dobbeltsjekke gRNA-oligosekvensen og, hvis det er korrekt, vælge yderligere bakteriekolonier til screening af restriktionsfordøjelse. Hvis transfektionseffektivitet og cellelevedygtighed er lav efter elektroporering, er det tilrådeligt at gentage protokollen ved hjælp af flere celler pr. Tilstand og reducere tiden for celledissociation til 3 minutter.
Skønt genereringen af CRISPR-concatemers er forholdsvis billig og nem, er det ikke muligt at udføre større skala genetiske skærme i organoider, da skalaen er begrænset af omkostningerne forbundet med organoid kultur og af dets arbejdskrævende karakter. Det er værd at nævne i dette tilfælde, at CRISPR-concatemer-metoden også er kompatibel med cellelinjer, såsom HEK293 og musembryoniske stamceller.
Uanset cellesystemet er en anden potentiel ulempe ved denne sTrategy kan opstå, når man sigter mod samtidig udfald af tre eller fire forskellige gener. For eksempel vil hver gRNA have en anden målretningseffektivitet, og ændringerne i at ramme alle generne på samme tid kan være relativt lave; Af denne grund er det tilrådeligt at anvende concatemer-systemet til at styre mere end et gRNA mod det samme gen.
Alternative strategier baseret på Golden Gate-shuffling er blevet foreslået gennem årene for at generere multiplex-gRNA-vektorer 7 , 8 . Imidlertid er det i vores metode muligt at montere flere gRNA'er direkte i en enkelt retroviral vektor i en enkelt kloningsrunde, hvilket gør den egnet til at generere gRNA-biblioteker for at målrette paraloger.
Vores CRISPR-concatemer er bygget i den MSCV retrovirale vektor backbone. Således kan gRNA-concatemer-holdigt retrovirus anvendes til at generere stabile cellelinier, der overexplodererRess gRNA'er. Når det kombineres med et Cas9-inducerbart system, kan man udføre inducerbare paralogue knockouts ved hjælp af vores system.
Sammenfattende beskriver vi her hvordan man klonrer op til fire forskellige gRNA'er i samme vektor i et trin og hvordan man anvender denne strategi for organoidkultur med en høj transfektionseffektivitet. Derudover giver vi nyttige forslag til at maksimere chancerne for succes gennem hele proceduren.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christopher Hindley for den kritiske læsning af manuskriptet. AM understøttes af Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Støttes af Medical Research Council (MRC) og BK.K. Og RM støttes af en Sir Henry Dale Fellowship fra Wellcome Trust og Royal Society [101241 / Z / 13 / Z] og modtager støtte gennem et kernetilskud fra Wellcome Trust og MRC til Wellcome Trust – MRC Cambridge Stem Cell Institute .
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |