该协议展示了一个简单, 稳健和高吞吐量单分子流动拉伸试验研究 one-dimensional (1D) 分子沿 DNA 扩散。
我们描述了一个简单的, 健壮的和高通量的单分子流拉伸试验, 研究分子沿 DNA 的1D 扩散。在这种测定中, 玻璃片是功能化的 one-step 反应与硅烷 PEG-生物素。流动细胞是由夹在功能化的片和一个含有入口和出口孔的硅橡胶板之间的预通道上的粘胶带构造的。多个通道被集成到一个流动单元中, 并且每个通道的试剂流可以完全自动化, 这大大提高了化验的吞吐量, 并减少了每次化验的动手时间。在每个通道内, 生物素-λ-dna 在表面上是固定的, 层流被应用于 dna 的流动延伸。DNA 分子被拉伸至 #62; 80% 的轮廓长度, 并作为空间扩展模板, 研究荧光标记分子的结合和运输活动。通过延时全内反射荧光 (TIRF) 成像跟踪单个分子的轨迹。原始图像的分析使用简化的定制单粒子跟踪软件, 自动识别的轨迹, 单分子扩散沿 DNA 和估计其1D 扩散常数。
生物学中的一个长期存在的问题是, 在基因组中的特定部位的内源性蛋白质如何能够迅速地找到他们的 DNA 目标, 从而使生物体生存并对其环境做出有效的反应。过去四十年的研究提出并大体上支持一个假设, 即蛋白质的 DNA 靶向搜索的动力学可以通过促进扩散来加速, 其中蛋白质在体积和1D 扩散的3D 扩散之间交替 (包括滑动和跳跃过程) 沿 DNA1。现在已知许多涉及基因调控、核酸代谢和其他过程的蛋白质都能在 DNA 上滑动2,3,4,5,6,7 ,8,9。此外, 最近的研究报告说, 即使是小肽也能与携带货物的能力结合在一起并滑动到 DNA 上;例如, 蛋白质分子或 PCR 引物, 沿 DNA10,11,12,13,14。
在过去的15年中, 单分子流拉伸试验已被广泛用于研究分子的结合和扩散的 DNA2,15,16。在这种类型的检测中, 化双 dna 分子被固定在表面上, 层流被应用于 dna 的流动。#62; 80% 伸展的 dna 充当空间扩展的模板, 用于研究标记有荧光的分子的结合和运输活动, 其中单分子沿 DNA 的轨迹通过延时荧光成像来跟踪。在我们的实施, 优化的重现性和易用性, 该试验包括五主要步骤: 生物素-λ-DNA 的制备, 片功能化, 流细胞结构, 荧光成像和数据分析。在以前的协议17中, 玻璃片功能化的第一反应与 (3-氨基丙基) 烷 (APTES), 然后与胺反应聚乙二醇 (peg) 试剂 (如, NHS-peg-生物素), 形成一个 PEG 层, 抗拒对片表面的测定组分进行非特异性吸附。官能化片的质量主要取决于 PEG 试剂的质量和各步骤的反应条件。我们的协议描述了一个简化的功能化协议和多路流细胞结构, 不需要在当天的流动细胞上组装液体粘合剂或固化时间。我们还描述了一个简化和健壮的数据分析过程11 , 通过应用径向对称方法来消除计算密集型的回归步骤, 用于质心本地化18和 covariance-based 扩散常量估计器19。
在这里, 我们报告一个简单, 稳健和高吞吐量单分子流拉伸试验的实现, 并在片功能化, 流细胞结构和数据分析作出重大改进。特别是, 我们开发了 one-step 片功能化协议, 其中清洁干片直接反应与硅烷 PEG-生物素。该协议简化了片的制备, 提高了功能化表面质量与标准 two-step 反应协议的可靠性。我们描述了使用的片与多通道的多路硅橡胶流细胞, 使可靠的油管连接, 不粘胶。这些流动细胞进一步包括多个计算机控制的入口为每个流室, 使自动化的试剂流, 以减少动手时间在设置和增加化验吞吐量。
从传统的 two-step 片功能化反应协议切换到 one-step 反应协议时, 我们注意到片功能性的可靠性得到了显著的提高。由于片准备的总动手时间少于三十分钟, 我们建议每天准备新的片单分子成像计划。为了减少硅烷-PEG-生物素的变质, 试剂应在收到时在-20 ° c aliquoted 和储存在干 N2气体下。在这里, 我们不使用产生-首席运营官–或 CH3终端组的 PEG 分子在过去的20中使用。使用的负电荷–组和疏水 CH3组分别用于防止 DNA 分子和特定蛋白质样品在表面上的非特异性吸附。我们观察到在完全生物素终止的 peg 表面上的小肽样品对表面的吸附非常低, 而硅烷 peg-羧基和/或硅烷 peg-CH3可能对某些蛋白质样品的化验或化验条件 (如 pH 值和 #60) 有用。促进 DNA 表面的相互作用。
从玻璃滑动流细胞到硅橡胶流细胞的转变加速了流动细胞的构建, 并使多个通道易于集成。我们经常为每个流动单元设计八通道, 使每一个功能化的片有八独立的实验。为了进一步提高每片的吞吐量, 甚至可以使用更大数量的微制造通道。
建议在初始充填后, 在任何一点上防止气泡在通道内形成。通常情况下, 气泡不会导致 dna 的丢失 (虽然这是可能的), 但会扰乱流动, 并可能导致 dna 黏附在片。缓冲除气和小表面活性剂数量的增加通常是有效的防止气泡形成在油管和流道。在将气泡引入油管的情况下, 试着在缓慢的气流中冲洗气泡, 并确保它们不会流经 dna 被栓的区域。
由于生成的数据量巨大, 因此简化和高效的数据分析软件至关重要。我们通常收集70万高分辨率的图像, 从测量的一个流电池, 可以处理使用我们的定制单一粒子跟踪软件在一天内的台式计算机的四核处理器和 32 Gb 内存。通过软件 (步骤 5.5) 检测1D 扩散轨迹的假阳性率是样本依赖性的, 并且可以相当低, 因为: 1) 视中的单个粒子的密度足够低, 因此在帧之间连接粒子的模糊性很小 (蛋白质样本一般更容易对片比肽样品的非特异性吸附, 因此, 每个蛋白质样品的缓冲和功率密度需要优化);2、单粒子的信噪比高, 使粒子的误识别概率低。尽管如此, 软件还是会偶尔出错, 我们建议使用所提供的 GUI 对数据进行手动检查, 以评估软件的性能。在对假阳性轨迹检测特别敏感的应用程序中, 可以更严格地设置包括阈值、minFrames、minTriplets 和 Chi2_stat 的过程参数, 以降低对真实绑定的敏感度轨迹识别中的事件和潜在的更大的统计偏差。我们在这里分享和描述我们的单粒子跟踪软件, 希望能帮助标准化数据分析方法, 并激发关于最佳实践的讨论。
在我们的协议中, 需要在成像过程中连续流动以保持 dna 模板分子的拉伸状态, 流体流动可能会使某些蛋白质沿 dna 模板传播, 如果它们通过跳跃机构扩散, 或者如果水动力标记的荧光的半径为大22,23。虽然这种偏倚可以在大多数数据集中进行测量和修正, 但以小荧光标记的蛋白质的传输和滑动机构的扩散通常不会被2,4的流量所检测到. 24。值得注意的是, 流速对沿 dna 传递蛋白质的影响, 已被用来研究蛋白质沿 dna 扩散的机制23。一个紧密相关的替代方法, 使测量在缺乏流动利用 dna 模板与生物素在两个总站, 瞬时伸展在流动和拴在两端的片, 使 dna 分子保持在当流关闭时的扩展配置25,26,27,28。double-tether 方法具有允许无流传输实验的优点, 但需要对 DNA 模板分子的两端进行修改, 在束缚过程中进行细致的流量控制, 并对两个栓点之间的距离进行表征。此外, 必须评估非均匀张力和 dna 构象动力学在 dna 分子上对分子测定的影响。
总而言之, 除了研究 dna 中分子的1D 扩散外, 作为报告的单分子检测可以使许多在试管中在单分子水平上的生物化学和生物物理研究受益, 包括 dna 目标搜索过程蛋白质, 酶在 DNA 上的活动, 等等。
故障
问题 1: 流道泄漏。
解决方案: 首先, 确保设计的流量通道允许至少1.5 毫米的边缘, 以密封周围和渠道之间;然后, 在流动单元的装配过程中, 确保片、double-adhesive 胶带和板坯之间的接触面是平坦的、干燥的和无碎屑的, 用于形成密封的压力是均匀的, 密封操作是在室温下执行。
问题 2: 栓系 dna 的密度过低。
解决方法: 当 PEG 功能化效率较低或 DNA 分子不能与生物素结合时, 就会出现此问题。从我们的经验来看, 栓 DNA 的密度应该高 #62; 90% 的片是由新鲜的或适当储存的硅烷-PEG-生物素试剂制成的。当系栓 dna 密度较低时, 经证实的生物素-λ-dna, 尝试在 peg 功能化过程中提高硅烷-peg-生物素的浓度, 在 dna 的亲和和生物素-λ-dna 的浓度。如果这失败, 更换 PEG 和亲和试剂。
问题 3: dna 粘片d 不能被水流拉长。
解决方法: 当 PEG 的功能化效率较低时, 也会出现此问题, 并因低 pH 值而加剧。尝试流动更多的 BSA 或提高 pH 值 (如 8.0), 以帮助抑制 DNA 对表面的吸附 (步骤 4.3.2)。如果 DNA 吸附在特定的测定条件下是一个持久的问题, 尝试在 peg 功能化过程中包括多达90% 的硅烷 peg 羧基。
数据分析说明:
我们使用定制的单粒子跟踪软件来识别沿 DNA 扩散的单分子的轨迹, 它们的1D 扩散常数, D1 估计。为了改进数据分析, 我们实现了径向对称算法18用于定位粒子和 covariance-based 估计器19 , 用于估计1D 扩散常数, 这极大地加快了数据分析, 而不会损害精度.我们以前通过分析模拟数据11来验证自定义软件。主要步骤如下所述。
粒子标识:
这一步是检测和分割粒子-衍射限制点-从背景。首先, 空间带通滤波器的图像, 以提高信号的粒子在3-5 像素范围 (对应于我们的系统上的点传播功能的大小), 然后阈值的基础上的强度 (见脚本: spt2_SD_sandbox)。
质心分配
将图像的本地化分子分割成像素级的空间分辨率。要将分子定位到更高的精确度, 请使用径向对称超分辨率算法18对图像进行筛选。(此方法基于分析计算, 从而大大降低了计算负担, 与其他流行的高精度方法 (如2D 高斯拟合) 相比 (参见脚本: spt2_SD_sandbox)。
粒子跟踪:
要通过时间跟踪粒子的轨迹, 我们必须重新相同的粒子在帧之间移动。我们认为启动、闪烁和终止阶段是轨迹的组成部分。我们将当前帧中的粒子与前一帧中的颗粒之间的连接限制为每个帧所允许的最大位移。在可能存在多个联系的情况下, 使用琼克-Volgenant 算法来生成全局最优链接集 (参见脚本: traceTraj4_kx. 3. m)。
D1 估计:
为了从轨迹中估计 D1 值, 我们使用基于协方差的估计器 (CVE)19。在分析计算的基础上, 这种方法比其他常用的方法, 如平均平方位移回归 (参见脚本: runspt5_SD), 具有更高的运算效率和统计严谨性。
弹道滤波:
有些轨迹包含工件, 如与表面结合分子的连结, 必须移除。我们实现了几个特点, 如最小的位移平行于 dna, 最大位移横向到 dna, 最小的弹道长度, 最小的三重连续检测到的位置, 和最低概率得分 (见雄等人 al11为定义), 可以过滤, 以隔离一组最小的偏差的轨迹可能代表分子扩散的 DNA (见脚本: sptViewFig2_update3x. m)。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢托尼 Kulesa, 罗宾帕特里克和塞帕斯 Gatzogiannis 的协助与初步仪器设置和测试。我们进一步感谢托尼 Kulesa 的重要帮助编写和评估定制的单一粒子跟踪软件。这项工作得到了启动资金和职业奖的支持, 在科学接口 (PCB) 从宝来惠康基金会。
Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
Script programming software | MathWorks | Matlab | |
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |