Summary
Этот протокол демонстрирует поток растяжения пробирного простой, надежный и высокая пропускная способность одной молекулы для изучения одномерный (1D) диффузии молекул вдоль ДНК.
Abstract
Мы описываем потока растяжения пробирного простой, надежный и высокая пропускная способность одной молекулы для изучения 1D диффузии молекул вдоль ДНК. В этот assay coverslips стекла являются функционализированных одношаговый реакции с силана PEG-биотин. Поток клетки построены сэндвич клейкой ленты с предварительно нарезанные каналов между функционализированных coverslip и PDMS плиты, содержащие впускных и выпускных отверстий. Множественные каналы интегрированы в один поток клеток и приток реагентов на каждый канал могут быть полностью автоматизированы, что значительно увеличивает пропускную способность пробирного и уменьшает руки раз в assay. Внутри каждого канала биотин λ-ННО лишенных подвижности на поверхности и ламинарные применяется для потока стретч ННО. Молекулы ДНК напряжены до > 80% от их контурная длина и служить как пространственно Расширенные шаблоны для изучения привязки и транспортной деятельности дневно обозначенных молекул. Траекторий одной молекулы отслеживаются в промежуток всего флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) изображений. RAW изображений анализируются с использованием усовершенствованный пользовательский одной частицы, отслеживания программного обеспечения автоматически определить траекторий одной молекулы, диффундирующих вдоль ДНК и оценить их 1D диффузия константы.
Introduction
Давнюю проблему в биологии — как эндогенных белки, которые действуют в конкретных сайтов в геноме можно найти их ДНК цели достаточно быстро для организма, чтобы выжить и эффективно реагировать на ее окружающей среды. Предлагаемые исследования за последние сорок лет и способствовало значительной поддержки, которую гипотеза, что кинетика ДНК целевой поиск белка может быть ускорен путем диффузии, в котором белка чередуется между 3D диффузии в объеме и 1 D распространения (включая Раздвижные и прыжковой процессов) вдоль ДНК1. Теперь известно, что многие белки, вовлеченных в регулирование гена, метаболизма нуклеиновых кислот и другие процессы способны скольжения на ДНК2,3,4,5,6,7 ,8,9. Кроме того недавние исследования сообщили, что даже малые пептиды могут связать и слайд на ДНК, с возможностью перевозки груза; например белковой молекулы или PCR праймер, вдоль ДНК10,11,12,,1314.
За последние 15 лет поток растяжения пробирного одной молекулы широко использовался для изучения привязки и диффузии молекул вдоль ДНК2,,1516. В этом типе пробирного, биотинилированным молекулы двуцепочечной ДНК иммобилизованных на поверхность и ламинарные применяется для потока растянуть ДНК. > 80% растягивается ННО служить как пространственно Расширенные шаблоны для изучения привязки и транспортной деятельности молекул, помечены флуорофоров где траекторий одной молекулы вдоль ДНК отслеживаются замедленной флуоресценции изображений. В нашей реализации, оптимизирован для воспроизводимости и простоты использования, этот assay состоит из пяти основных этапов: подготовка биотин λ-ДНК, coverslip функционализации, строительства клеток потока, флуоресценции визуализации и анализа данных. В предыдущих протоколах17coverslips стекла были функционализированных первых реагирующих с (3-аминопропил) triethoxysilane (APTES), а затем с Амин реактивной полиэтиленгликоля (PEG) реагенты (например, NHS-PEG-биотин) сформировать слой КОЛЫШЕК, что сопротивляется неспецифические адсорбции пробирного компонентов на coverslip поверхность. Качество функционализированных coverslips во многом зависит от качества PEG реагентов и условий реакции на каждом шагу. Наш протокол описывает упрощенный функционализации протокол и мультиплексной потока клеток строительство, которое требует не жидкий клей или время отверждения на клетки поток день собираются. Мы также описывают обтекаемый и надежные данные анализа процедуры11 устраняет вычислительных регрессии шаги путем применения метода радиальной симметрии центроид локализации18 и распространения на основе ковариации Постоянное оценщик19.
Здесь мы приводим простой, надежный и высокую пропускную способность одной молекулы потока растяжения пробирного осуществления с значительные улучшения, сделанные в coverslip функционализации, строительства клеток потока и анализа данных. В частности мы разработали одношаговый coverslip функционализации протокол, в котором чистой сухой coverslips реагировать непосредственно с силана PEG-биотин. Этот протокол упрощает подготовку coverslip и повышает надежность качества функционализированных поверхностей, по сравнению с стандартным двухэтапный протокол реакции. Мы описываем применения функционализированных так coverslips с многоканальным PDMS потока клеток, которые позволяют надежные трубы соединения без клея. Эти клетки потока далее включать несколько компьютерным управлением отверстия для каждой камеры потока позволяющие автоматизированных реагент потока для уменьшения практический время во время установки и увеличение пробирного пропускную способность.
Protocol
1. Подготовка биотин λ-ДНК
Примечание: биотин λ-ДНК молекул готовятся безлигатурные биотин меченых олигонуклеотида, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - биотин - 3 ' для Λ-ДНК молекул 20.
- Подготовить биотина 0,1 мм помечены oligo в буфере TE.
- Тепла фондовой λ-ДНК 0.5 мг/мл при 65 ° C для 60 s и окунуться в мокрый лед сразу.
Примечание: Быстрое охлаждение охлаждение снижает λ-ДНК concatemerization. - Пипетки 100 мкл раствора λ-ДНК в пробки microcentrifuge.
- Добавить 1 мкл oligo 0,1 мм в 9 мкл буфера TE.
- Добавить 2 мкл oligo решения microcentrifuge трубка, содержащая λ-ДНК. Тщательно перемешать.
Примечание: В приблизительно 12-fold Молярная превышение над конце комплементарной λ-ДНК присутствует Oligo. - Тепла λ-ДНК/oligo смеси при температуре 65 ° C для 60 s.
- Медленно охлаждать смесь до комнатной температуры.
Примечание: Этот шаг позволяет oligo для отжига в конце комплементарной λ-ДНК. - Поместить смесь на льду. 11 мкл T4 ДНК лигаза реакции буфера (окончательный буферной концентрации 1 x). Осторожно перемешать. Затем добавьте 2 мкл (800 единиц) T4 ДНК лигаза фермента. Смешайте нежно.
- Инкубировать смесь для 2 h на 16 ° C, или на ночь при 4 ° C.
- Очистить продукт с помощью центробежного фильтра трубы с номинальным молекулярный вес предел 100 кДа. В частности, передача шаг 1.9 смеси в трубы центробежного фильтра и центрифуги в 14.000 x g 5 мин, дважды промыть 400 мкл буфера TE и собирать очищенный продукт.
Примечание: Как чистый биотин λ-ННО в буфере TE стабильным на уровне-20 ° C на срок до одного года.
2. Функционализация Coverslip
Примечание: стекло coverslips функционализированных, реагируя с силана PEG-биотин. Этот протокол реакции одношаговый проще и надежнее в нашем опыте чем стандартный двухэтапный протокол реакции 20. Coverslip функционализация силана PEG-биотин создает привязки сайтов для стрептавидина и минимизирует неспецифических ДНК и белка адсорбции на поверхности coverslip.
Coverslips- Sonicate 5 № 1 в 95% этаноле внутри пятнать банку за 10 мин и затем промойте ультрачистая вода в три раза.
Примечание: Пятый coverslip предоставляет запчасти в случае поломки. - Заполнить окрашивание банку с 1 M Кох, sonicate за 10 минут и затем смойте ультрачистая вода три раза.
- Повторить два цикла 2.1-2.2.
- Сухой coverslips под чистой сухой потока газа N 2.
- Далее, чистой и сухой coverslips, применяя плазменной очистки воздуха на 900 mTorr давление на 5 мин
- Инкубировать coverslips с 25 мг/мл силана ПЭГ биотин, растворенного в 95% этаноле при комнатной температуре на 2 ч. конкретно, сэндвич-50 мкл силана ПЭГ биотин решения между двумя чистой сухой coverslips и инкубировать coverslip " бутерброды " внутри коробки кончик закрытой пипетку с около 10 мл воды на дне (не в контакте с coverslips) для сведения к минимуму испарения растворителя.
- Смыть излишки PEG молекул с ультрачистая вода и сухой КОЛЫШЕК с покрытием coverslips под чистой сухой N 2 газового потока.
Примечание: Функционализированных coverslips может храниться до трех суток при температуре окружающей среды.
3. Поток строительства клеток
Примечание: поток клетки построены сэндвич Двойной Скотч с предварительно нарезанные каналов между КОЛЫШКА функционализированных coverslip и PDMS плиты, содержащие впускных и выпускных отверстий. Множественные каналы интегрированы в клетку потока.
- Дизайн каналов потока в САПР и вырежьте каналы (ширина, глубина и продолжительность каждого каналов – 1, 0,13 и 12 мм, соответственно) на Двойной Скотч, используя резак ленты (обычно восемь каналов интегрированы в клетку потока). Удалить остатки ленты для формирования каналов потока.
- Сделать PDMS плит, тщательно перемешайте 45 g PDMS с 5 g crosslinking реагента (достаточно для изготовления двенадцать 5 мм толщиной PMDS плиты, которые могут храниться бессрочно атмосферных условиях) с помощью миксера, Вылейте смесь в два Петри 10 см и оставить блюда внутри вакуумной камеры до тех пор, пока по существу все воздушные пузырьки исчезли (вручную удалить пузырьки воздуха, если какой-либо остаются, когда блюда удаляются из вакуумной камеры). Затем перенесите блюда в духовке 80 ° C до PDMS застывает (около 2 ч).
- Вырезать PDMS плиты, которая соответствует размеру Двойной Скотч с предварительно нарезанные каналами. Пил один защитной пленки с двойной скотч и присоединиться фильм к плоской грани PDMS плиты. Выходе и входе отверстий на PDMS плиты с помощью биопсии перфоратора с 23 иглы.
- Пил второй фильм защита от Двойной Скотч и придерживаются Ассамблея PDMS-ленты функционализированных поверхности coverslip (убедитесь, что coverslip является плоской. Посмотреть картину полностью собранный потока ячейки на рисунке 1a).
4. TIRF Imaging
Примечание: биотин λ-ННО привязаны к поверхности канала потока и ламинарные применяется для потока растянуть молекулы ДНК ( рис. 1b). > 80% растягивается служить молекулы ДНК как пространственно Расширенные шаблоны для наблюдения за привязку и транспортной деятельности дневно обозначенных молекул. Отслеживаются траекторий одной молекулы с покадровой TIRF изображений ( рис. 1 c & e).
- Исправить ячейку потока на микроскоп этапа и нагрузки предварительной дегазации пустой буфер (фосфат натрия 10 мм, 2 мм NaCl, 50 мкм ЭДТА, этанол 20 мм, 5% (v/v) глицерина, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-меркаптоэтанол, рН 7,4), решения стрептавидина 0,2 мг/мл, 1 мг / решение бычьим сывороточным альбумином (БСА) мл и 100 вечера биотин λ-ДНК решение в четыре водохранилища, что каждый шланги Tygon подключен к значению электромагнитный и другой шланги Tygon подключен к ЗАГЛЯНУТЬ труб Оплеточные шланги Tygon над мелких труб (PEEK предотвращает обратный реагентов). Дега небольших объемов буфера ночь воздействием вакуума или короче воздействием вакуума с перемешивания (до тех пор, пока больше не видны пузырьки).
- Вставьте трубки PEEK пустой буфер водохранилища в одно входное отверстие потока ячейки. Премьер канал течет в пустой буфер и вставьте три других труб ЗАГЛЯНУТЬ в впускного отверстия управляемый поток каждого реагента давление воздуха управляется электромагнитные клапаны и полностью автоматизирована через сценарий компьютера. Будьте осторожны, чтобы не вызывать образование пузырь воздуха в канале.
- Подключение шланги Tygon с короткой трубки PEEK от розетки отверстие в контейнер для отходов. Короткие трубки PEEK на выходе помогает подавить формирования пузыря воздуха во время инфузии путем поддержания положительного давления внутри канала.
- Привязывать биотин λ-ДНК молекул на поверхности канала потока.
- Потока в решения стрептавидина 0,2 мг/мл, инкубировать на 5 мин и затем поток в пустой буфер промыть несвязанных стрептавидина.
- Потока в растворе 1 мг/мл BSA, инкубировать в течение 1 мин и затем поток в пустой буфер промыть несвязанных BSA.
Примечание: BSA дальнейшее подавляет ДНК и образец адсорбции на поверхности. - Потока в 100 пп биотин λ-ДНК решения, Проинкубируйте втечение 10 мин и затем поток в пустой буфер промыть несвязанных DNAs.
Примечание: После того, как ДНК привязан к поверхности, Избегайте быстрых потоков для предотвращения повреждения привязанный молекул ДНК.
- Для проверки качества функционализированных coverslip потока в ДНК пятнать краска например Sytox оранжевый в условиях пробирного использоваться (чтение 4.6 ниже) и начать флуоресценции изображений под 532 нм лазер освещения.
Примечание: Качество функционализированных coverslip обычно хорошее и плотность потока растягивается молекул ДНК будет высоким. Важно иметь достаточно высокую плотность потока растягивается молекул ДНК, чтобы ДНК привязки и скольжения / 1D распространения событий может наблюдаться. - Изобразительных настроить угол TIRF для достижения лучшее соотношение сигнал-шум изображения растягивается молекул ДНК ( рис. 1 d).
- Для записи траектории одной молекулы, двигаясь вдоль ДНК, повторите шаги 4.2-4.4 внутри новый канал (без ДНК пятнать краситель), затем влить предварительной дегазации суб наномолярных Флюорофор помечены молекул на достаточно высокий расход потока, используя шприцевый насос и собирать изображения замедленной флуоресценции с частота кадров 100 Гц.
Примечание: Скорость потока эквивалентное число Вайсенберга (Wi: безразмерные продукт долгое время релаксации полимер - около 0,2 s λ-ДНК - и скорости сдвига - изменение скорости потока с расстоянием от поверхности coverslip) 500 внутри для одной молекулы изображений с частотой кадров 100 Гц 21 рекомендуется канал.- Собирать 10000 кадров в одном поле зрения (FOV) производить кино, и собирать подобные фильмы из нескольких (обычно десять) FOVs на сэмпл.
Примечание: Плотность одной частицы в одном ПЗ должны быть ни слишком высоко - которая затруднит анализ данных, делая Присваивание объекта во всех кадрах двусмысленным, ни слишком низко -, которая может привести к низкой возникновение событий одной молекулы ДНК. - Оптимизировать интенсивности освещения, так что молекулы, привязан к coverslip поверхности, быстро фото отбеленная подавить фона, тогда как молекулы, диффундирующих на ДНК не являются слишком быстро отбеленные, так что больше траектории могут быть обнаружены.
Примечание: Мы обычно используем плотность мощности 200-800 Вт/см 2 в FOV.
- Собирать 10000 кадров в одном поле зрения (FOV) производить кино, и собирать подобные фильмы из нескольких (обычно десять) FOVs на сэмпл.
- В конце шага 4.6, влить ДНК пятнать краситель для подтверждения, что молекулы ДНК может быть растянуто потока.
- Выполнение обоих примеров положительной и отрицательной контроля.
Примечание: Хороший положительный контроль является tetrapeptide, тетраметилродамина (ПМР)-KRRR (ПМР вместе с N-терминальный Амин) которая имеет среднее 1D диффузии 10.5 ± 0,7 (стандартная ошибка) М (bp 2/s) нейтральным рН 11. Хороший отрицательный контроль является измерение помечены образцов интереса в Пробирной буфера в канале, который имеет не ДНК, привязал, где должно быть обнаружено никакой деятельности на ДНК диффузии.
5. Анализ данных:
Примечание: пользовательские одной частицы, отслеживания программного обеспечения используется для определения траектории одной молекулы, диффундирующих вдоль ДНК и оценить диффузии константы. Это программное обеспечение сначала определяет центроид позиции одной частицы с высокой точностью, идентифицирует частицы, которые застряли на coverslip поверхности и затем связывает частицы в разных кадрах сформировать отснятого траектории. От этих траекторий, оцениваются 1D диффузия константы.
- Начать анализ данных, открыть сценариев программного обеспечения (см. таблицу материалов) и перейдите в каталог одной частицы, отслеживания программного обеспечения. Откройте скрипт с именем " largedataprocess3.m ". Один важный параметр, чтобы определить это пороговое значение для обнаружения одной частице. Запустите
- для определения оптимального порогового значения, " Determine_threshold_value.m " сценарий. Этот сценарий будет указано, как пороговое значение влияет на обнаружение одной частицы. После определения оптимального порогового значения, запустите " largedataprocess3.m " script.
- После завершения одной частицы отслеживания анализа, фильтрации сырье траекторий, запустив " Trajectory_filtering.m " сценарий. Графический интерфейс пользователя (GUI) построен визуализировать фильтрации шаг. Группа
- на GUI, установите минимальное перемещение вдоль ДНК, MinXDisp, 2 пикселей присвоено максимальное перемещение поперечных ДНК, MaxYDisp, 2 пикселей задать минимальное количество кадров, minFrames, 10; установить минимальное количество государств триплет, minTriplets, 10; Установите минимальный уровень диффузии вдоль ДНК, D_par, 0; Установите максимальное расчетное диффузии поперечной ДНК, D_trans,-10 М (2 bp) S -1; значение параметра Минимальный статистика, Чи 2 _stat, -5; установить минимальное соотношение перемещения вдоль ДНК, поперечно к ДНК, шалунья/Y, 2.
Примечание: Все сырье траектории, которые проходят эти параметры фильтрования, перечислены в таблице 1, и те, которые не перечислены в таблице 3. - Нажмите на траектории количество в таблице 1, траектории будут перемещены в графика 1 & 2. Нажмите на " играть " кнопку для воспроизведения изображений raw флуоресценции. Нажмите на " Add_to_Table2 " для определения траектории как одной молекулы скольжения траектории. В конце концов, все траектории, добавляется Table2 будут сохранены при закрытии GUI.
- Для вычисления константы средняя диффузия, запустите сценарий " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Средняя диффузии оценивается из множества траекторий, которые прошли все фильтрации шаги и были добавлены в таблицу 2.
Representative Results
Рисунок 2a показывает обнаруженные траектории pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B, конъюгированных с остатков цистеина) молекулы, диффундирующих на ДНК в 2 мм NaCl буфера рН 6,5. Распространение pVIc является двунаправленным и управляется окружающего тепловой энергии. От этих траекторий, 1D диффузия константы (значения D1) оцениваются для каждой траектории (см. гистограммы в Рисунок 2b). Среднее значение D1 этот конъюгат pVIc рассчитывается 22.2 ± 0,9 (стандартная ошибка) М (bp2/s) путем усреднения каждое значение D1 через траекторий, взвешенных по числу триплет подряд позиции призывы, содержащиеся в каждой траектории.
Рисунок 1 : Аппарат для отслеживания движения молекул одного вдоль ДНК.
) PDMS 8 канальный microfluidic чип придерживаться функционализированных coverslip, к которому могут привязал ДНК (с США Монета четверти шкалы); b) потока клеток масштаб схемы показаны потока протянул λ-ДНК молекул; c) схема системы TIRF микроскоп и потока для растяжения ДНК; d) TIRF изображение растягивается потока λ-ДНК; e) TIRF образ pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B, конъюгированных с остатков цистеина) молекулы привязан к поток протянул λ-ДНК. Эта цифра была изменена с разрешения2,12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Одномерный диффузии по pVIc (GVQSLKRRRCF) вдоль ДНК.
). распространение pVIc вдоль потока растягивается λ-ННО (137 траектории) в буфере 2 мм NaCl при рН 6,5. x(t) и y(t) являются перемещения вдоль и поперечной λ-ДНК, соответственно. Пунктирные горизонтальные линии указывают отсутствующие точки, связанные с мигать окрашивания. b). гистограмма диффузии, D1 для pVIc, диффундирующих вдоль λ-ННО. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
При переходе от традиционной двухэтапный coverslip функционализации реакции протокола к протоколу реакции Одношаговая, мы заметили, что надежность coverslip функционализации значительно улучшилась. Как общий практический время для подготовки coverslip менее чем за тридцать минут, мы рекомендуем что готовит свежий coverslips каждый день одной молекулы изображений планируется. Чтобы свести к минимуму ухудшение силана PEG-биотин, реагент должно быть aliquoted и хранятся под сухой газ N2 при-20 ° C при получении. Здесь мы не используем PEG молекулы, которые производят -ку– или -CH3 терминал группы, которые были использованы в прошлом20. Отрицательными зарядами -ку– и гидрофобных групп3 -CH использовались для предотвращения неспецифических адсорбции молекул ДНК и конкретных белка образцов на поверхность, соответственно. Мы наблюдаем очень низким поверхности адсорбции небольших пептидных образцы на поверхности полностью биотин завершенной PEG, в то время как силан PEG-COOH или силана PEG-CH-3 может быть полезным для анализов некоторых образцов белка или когда анализа условий (таких как рН < 7,5) поощрение взаимодействия ДНК поверхности.
Переход от стекла слайд потока клеток к PDMS потока клетки ускоряет строительство клеток потока и позволяет легко интегрировать несколько каналов. Мы часто инженер восемь каналов на поток ячейку, чтобы включить восемь независимых экспериментов на функционализированных coverslip. Для дальнейшего повышения пропускной способности в coverslip, могут использоваться даже большее число микро сфабрикованы каналов.
Желательно, чтобы предотвратить образование пузырь воздуха внутри канала в любой момент после первоначального заполнения. Обычно, пузырьки воздуха приводит к потере привязанный ННО (хотя это возможно), но скорее нарушить поток и привести к ННО придерживаться coverslip. Буфера дегазации и добавлением небольших ПАВ количествах обычно эффективны в предотвращении формирования пузырь внутри труб и потока канала. В тех случаях, когда пузырьки воздуха вводятся для труб попробуйте промыть пузырьков под медленным потоком и убедитесь, что они не проходят через этот регион, где на привязи ННО.
Программное обеспечение для анализа данных рациональной и эффективной является критическим, из-за огромного количества данных. Мы обычно собирают 700 000 изображений с высоким разрешением от измерений на ячейку один поток, который может быть обработан с помощью наших пользовательских одной частицы, отслеживания программного обеспечения в течение одного дня на настольном компьютере с четырехъядерный процессор и 32 ГБ памяти. Ложные положительные темпы обнаружения 1 траекторий распространения программного обеспечения (шаг 5.5) является образцом зависимых и может быть довольно низкой, учитывая, что: 1) плотность одной частицы в ПЗ является достаточно низким, так что есть мало неоднозначности ссылок частиц через кадры ( образцы протеина в целом более склонны к неспецифическим адсорбции coverslip чем пептид образцы, и таким образом, буфера и плотность энергии для каждого белка образец должен быть оптимизирован); 2 отношение сигнал-шум одного частиц является достаточно высоким, так что вероятность ложь идентификации частиц является низким. Тем не менее программное обеспечение может делать случайные ошибки, и мы рекомендуем ручной проверки данных с использованием предоставленного GUI для оценки производительности программного обеспечения. Особенно чувствительны к ложно положительных траектории обнаружения приложения параметры процесса, включая пороговое значение, minFrames, minTriplets и Чи2_stat можно задать более строго ценой ниже чувствительности для истинной привязки события и потенциально более статистической погрешности в идентификации траектории. Здесь мы разделяем и описать нашу одной частицы, отслеживания программного обеспечения в надежде помочь стандартизировать методы анализа данных и стимулировать дискуссию о наилучшей практике.
В нашем протокол, который требует непрерывного потока во время обработки изображений для поддержания натянутой состояния шаблона молекул ДНК, потока жидкости может смещения перевозки некоторых белков вдоль ДНК шаблоны, если они диффузного прыжковой механизмом или гидродинамических Радиус помечены Флюорофор является большой22,23. Хотя такая предвзятость можно измерить и исправлены в большинстве наборов данных, транспортных белков помечены с небольшой Флюорофор и диффундирующих раздвижной механизм не предвзятым обычно обнаруживаемая степени потока2,4, 24. В частности влияние скорости потока на транспортных белков вдоль ДНК был использован для изучения механизмов белка, диффундирующих вдоль ДНК23. А тесно связанных альтернативный подход, который позволяет измерений в отсутствие потока использует шаблоны ДНК с биотина в обоих Термини, которые временно растягиваются в потоке и привязал на обоих концах для coverslip такой, что молекулы ДНК остаются в Расширенная конфигурация, когда поток выключен25,26,27,28. Троса двойной подход имеет преимущество, позволяя экспериментов свободного потока транспорта, но требует изменения обоих концах молекул ДНК шаблон, во время привязь пасущегося животного и характеризующие расстояния между двумя сайтами привязанный тщательного потока управления. Кроме того необходимо оценивать влияние гетерогенных напряженности и конформационные динамики ДНК через молекул ДНК на сингл молекула assay.
В общей сложности помимо изучения 1 D диффузии молекул вдоль ДНК, как сообщили одной молекулы assay может принести пользу многих в vitro биохимические и биофизические исследования на уровне одной молекулы, включая ДНК целевых Поиск процессов белки, ферментативную деятельность на ДНК и многое другое.
Устранение неполадок
Проблема 1: Поток каналы утечки.
Решение: Во-первых, убедитесь, что дизайн каналов потока позволяет по крайней мере 1.5 мм маржа для уплотнения вокруг и между каналами; а затем, во время Ассамблеи потока ячейки, убедитесь, контактных поверхностей между coverslip, двойной клейкая лента и PDMS плиты плоские, сухой и свободной от мусора, что давление сформировать печать равномерным, и что операция запечатывания выполняется при комнатной температуре.
Проблема 2: Плотность привязанный ННО слишком низка.
Решение: Эта проблема возникает, когда эффективность функционализации PEG низка или молекулы ДНК не функционализированных с биотин. Из нашего опыта, плотность привязанный ДНК должны быть высокими для > 90% coverslips готовится из свежих или надлежащим образом хранить силана PEG-биотин реагента. В тех случаях, когда плотность привязанный ДНК низка с проверенной партии биотин λ-ДНК, попробуйте, повышение концентрации силана PEG-биотин во время PEG функционализации и концентрации стрептавидина и биотин λ-ДНК в ДНК привязывать. Если это не удается, замените PEG и стрептавидина реагентов.
Проблема 3: ННО придерживаться coverslipd не может быть растянут потоком.
Решение: Эта проблема также может возникнуть, когда PEG функционализации эффективность низка и усугубляется низкими пробирного рН. Попробуйте течет более BSA или повышение pH (например до 8.0) чтобы помочь подавить ДНК адсорбции на поверхности (шаг 4.3.2). Если ДНК адсорбции стойких проблема при условии определенного анализа, попробуйте включая до 90% силана PEG-COOH при функционализации КОЛЫШЕК.
Данные примечания:
Мы используем пользовательский одной частицы, отслеживания программного обеспечения для определения траектории одной молекулы, диффундирующих вдоль ДНК, от которого оцениваются их 1D диффузия константы, D1. Для улучшения анализа данных, мы реализован алгоритм радиальной симметрии18 для локализации частиц и оценщик на основе ковариации19 для оценки 1 D диффузия констант, которые резко ускорить анализ данных без ущерба для точность. Мы ранее подтверждены заказного программного обеспечения анализа смоделированных данных11. Основные шаги описаны ниже.
Идентификации частиц:
Этот шаг предназначен для обнаружения и сегментации частицы - дифракционный пятна - от фона. Во-первых, пространственно-полосовой фильтр изображений для повышения сигнал частиц в 3-5 пикселей диапазона (что соответствует размеру точки распространения функция на нашей системы) и затем порог, основанный на интенсивности (см. сценарий: spt2_SD_sandbox.m).
Центроид назначение
Сегментации изображения только локализует молекул pixel уровня пространственного разрешения. Чтобы локализовать молекул с гораздо более высокой точностью, применять радиальной симметрии, супер резолюции алгоритм18 изображения фильтруются как выше. (Этот метод основан на аналитический расчет и таким образом значительно уменьшает вычислительной нагрузки по сравнению с других популярных высокоточные методы, такие как 2D Гаусса установку (см. сценарий: spt2_SD_sandbox.m).)
Частица отслеживания:
Чтобы отследить траекторию частицы через время, мы должны заново определить же частицы как они перемещаться между кадрами. Мы рассмотрим стадии посвящения, мигает и прекращение компонентами траектории. Мы ограничить связь частиц в текущих кадрах для тех, кто появляется в предыдущие кадры, максимальное перемещение допускается в кадре. В тех случаях, когда возможны несколько связей, используется алгоритм Йонкер-Volgenant приносить глобально оптимальное связь наборы (см. сценарий: traceTraj4_kx.3.m).
Оценка D1:
Чтобы оценить значения D1 от траектории, мы используем на основе ковариации оценщик (CVE)19. На основе аналитического расчета, этот метод более вычислительно эффективна и статистически строгими, чем другие часто используемые методы, такие как регрессии среднего квадрата перемещений (см. сценарий: runspt5_SD.m).
Траектории фильтрации:
Некоторые траектории содержат артефакты, такие как связь с привязкой к поверхности молекул и должны быть удалены. Мы реализовали несколько функций, таких как минимальные перемещения параллельно с ДНК, максимальное смещение поперечной ДНК, минимальная длина траектории, минимальное количество триплет подряд обнаружено позиций и минимальную оценку вероятности (см. Сюн et al11 для определения), могут быть отфильтрованы изолировать набор минимально предвзятым траекторий, вероятно, представлять молекул, диффундирующих на ДНК (см. сценарий: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Широкой Институт может избрать для подачи патентных заявок, которые включают аспекты работы, представленные здесь.
Acknowledgments
Мы благодарим Тони Kulesa, Робин Киркпатрик и Эвангелос Gatzogiannis за помощь с первоначальных приборов установки и тестирования. Мы далее поблагодарить Тони Kulesa за значительную помощь написание и оценки индивидуальных одной частицы, отслеживания программного обеспечения. Эта работа была поддержана запуска финансирование и карьера премии в научной интерфейс (PCB) от Фонда Добро пожаловать Берроуз.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al.
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
