Nanopore teknik för sekvensering biomolekyler har breda tillämpningar inom life science, inklusive identifiering av patogener, mat säkerhetsövervakning, genomanalys, metagenomic miljöövervakning och karakterisering av bakteriell antibiotikaresistens. I denna artikel demonstreras förfarandet för gjorts jord DNA-sekvensering för artbestämning med hjälp av nanopore sekvensering teknik.
Denna artikel beskriver stegen för byggandet av ett DNA-bibliotek från jord, beredning och användning av cellen nanopore flöde, och analys av de DNA-sekvenser som identifieras med hjälp av datorprogram. Nanopore DNA-sekvensering är en flexibel teknik som möjliggör snabb mikrobiell Genomsekvensering att identifiera bakteriella och virala arter, att karakterisera bakteriestammar och upptäcka genetiska mutationer som ger resistens mot antibiotika. Fördelarna med nanopore ordningsföljd (NS) för biovetenskap är dess låg komplexitet, minskad kostnad och snabb realtid sekvensering av renat genomiskt DNA, PCR-amplikoner, cDNA prover eller RNA. NS är ett exempel på ”strand sekvensering” som innebär sekvensering DNA genom att styra en enda stranded DNA molekyl genom en nanopore som är infogat i en syntetisk polymer membran. Membranet har en elektrisk ström som tillämpas i hela det, så som de enskilda grunderna passera genom nanopore den elektriska strömmen störs i varierande grad av de fyra nucleotide baserna. Identifiering av varje nukleotid uppstår genom att upptäcka den karakteristiska moduleringen av den elektriska strömmen av de olika baserna när de passerar genom nanopore. NS systemet består av en handenhet, USB powered bärbar enhet och en disponibel flöde cell som innehåller en nanopore matris. Den bärbara enheten ansluts till en vanlig bärbar dator som läser och registrerar den DNA-sekvens som använder datorprogram.
Målet med detta förfarande är att visa de steg som krävs för beredning av en miljö DNA-bibliotek för sekvensering, utnyttjande av en nanopore flöde cell sekvensering enhet, och att utföra analys av de genererade DNA-sekvenser som använder systemprogramvaran och National Center for Biotechnology Information (NCBI) bioinformatiska verktyg att identifiera mikrobiell arter i jord. För närvarande, kräver de flesta DNA sekvensering plattformar en stor investering i teknisk utbildning och komplexa instrumentation, som inte är genomförbart i resurs fattiga miljöer eller i området tillämpningar. Nanopore sekvensering (NS) plattformen eliminerar problemen med en kostnadseffektiv, enkel att använda bibliotek förberedelse protokoll och en bärbar enhet att sekvensera och analysera en mängd olika typer av nukleinsyror1,3. Vi har införlivat NS plattformen i flera lab klasser för magisterexamen studenter.
Nanopore teknik för sekvensering biomolekyler har visat breda tillämpningar inom life science, inklusive identifiering av bakteriella och virala patogener1,2,6, miljömässiga biologisk mångfald studier, mat säkerhetsövervakning, genomanalys3,5och karakterisering av bakteriell resistens mot antibiotika4. NS är en snabb och noggrann metod för att sekvensen nukleinsyror som är baserad på principen om ”strand sekvensering” genom att upptäcka elektriska störningar av enskilda nucleotide baser när enda stranded DNA passerar genom en nanopore som infogas i en elektrifierad syntetisk polymer membran. De olika stegen i förberedelserna DNA för NS inkluderar genomet fragmentering, slutet reparation och 3′ dA-tailing genomisk fragment, adapter och tjuder glödgning av DNA, DNA bibliotek rening och fylla på biblioteket i nanopore flöde cell enheten. Fragmentering av genomet in ~ 8 kb storlekar sker genom centrifugering 1-2 µg genomiskt DNA genom en g-tub fragmentering slang. Fragmenterade genomisk ändarna sedan repareras och stjärt med poly dA använder en kommersiellt tillgänglig kit. Enda stranded kort sekvenser, som är förenliga med nanopore motor proteinet, läggs till DNA-ändarna som används för att vägleda den DNA-sekvensen genom nanopore (figur 1). Tjuder sekvenser krävs för DNA-rening och lokalisera DNA-molekylerna till pore membranet. Hårnål genereras av ligating en hårnål-adaptern till ena änden av dA tailed biblioteket. Hårnål strukturerna i DNA-ändarna tillåter läsning av förnuft och antisense strandar DNA passerar genom nanopore (figur 2). Den beredda genombibliotek renas sedan från reaktionen med hjälp av streptividin pärlor med hjälp av ett magnetfält, följt av lastning provet i cellen nanopore flöde för analys.
Sekvenserade DNA bedöms för kvalitet och sekvensering läsningar som är godtagbara för analys utsätts sedan för flera bioinformatiska verktyg att identifiera mikrober. Sekvenserna översätts ”” till en FASTQ från ett FAST5 format. I formatet FASTQ, kan sekvenser sedan användas i BLAST analys.
Många nästa generations sekvenseringsmetoder har genererats och varje beror på sekvensering av syntes men upptäckt plattformarna för att identifiera nukleotider skiljer sig åt. NS, det senaste tillskottet till marknadsplatsen, använder en annan metod helt, som inte kräver en sekvensering reaktion eller märkta nukleotider. Denna metod tar fördel av kostnad differential redan bildat nukleotider när de passerar genom en elektrifierad pore. Identifiering av varje nukleotid sker genom modulering av den elektriska strömmen genom de olika baserna när de passerar genom nanopore. Detta multiplexering system tillåter användaren att sekvensera många fragment i taget. Genom att sekvensera båda delarna av DNA, riktigheten av sekvensen ökas betydligt och den sekvensering programvara, som kan läsas på en bärbar dator, bearbetar signalerna och ger den information om aktivitetssekvens som kan analyseras.
I pyrosekvensering, en sekvensering av syntesmetod (SBS), beror påvisande av specifika basen införlivas med mallen på luciferas analysen och generering av Kemiluminiscens signaler8. I ion semiconductor sekvensering upptäcks den släppta vätejon, vilket minskar pH-värdet av en ion sensor9. Enda molekyl realtid sekvensering beror på noll läge wave guide (ZMW)10, som lyser upp för upptäckt en fluorescerande molekyl taggade till den inbyggda nukleotid. SBS använder en unik metod för att förstärka mål-DNA så att kluster av unika sekvenser är genererade13. Identifiering av den tillagda nukleotid uppnås när fluorescensen av den märkta nukleotid registreras. NS har däremot unik fördel gentemot andra metoder att det kräver begränsade tekniska resurser, är bärbar, producerar länge sekvensering läsningar, kräver ingen tidigare DNA-amplifiering och kan manövreras till lägre kostnad jämfört med andra metoder. Våra elever hittade det nya, Snabb bibliotek prep protokollet vara okomplicerad och mottaglig för en tre timmars lab klass. Några av de frågor som vi stött var bubblor i cellen flöde som var svåra att ta bort, det krävs betydande datorkraft (en terabyte lagringsutrymme), den nuvarande produktionen av data är i en FAST5 fil och sekvensering flöde cellen har en begränsad hållbarhet innan det försämras. Andra nackdelar av protokollet NS Ligation sekvensering (lång protocol) är dessutom att den kräver flera bibliotek förberedelser, kräver expertis inom molekylärbiologi tekniker och genererar reducerad sekvensering trohet jämfört med vissa sekvensering metoder3. Men senaste framstegen med den nya snabba bibliotek förberedelser kit kräver endast 10 min för bibliotek förberedelse och har visat en minskad sekvensering felprocent. Metoden för beredning av nya bibliotek var mycket mottagliga för användning i en lab-klass.
Det finns flera kritiska steg i protokollet, särskilt i QC av cellen flöde. Detta inkluderar utföra en inledande QC inom fem dagar efter mottagandet av cellen flöde och använder dem inom 8 veckor. Även om vi har använt flödesceller som var längre än 8 veckor, minskas avsevärt antalet öppna/aktiv porer. Det är viktigt att experiment planeras att passa en tidslinje där maximal användning av de flöde cellerna är uppnått. Vi har använt rengöring protokollet och återanvändas flödesceller med framgång.
Utreda metagenomik jord representerar en outnyttjad genetiska reservoar av mikrobiell mångfald. Exempelvis ett gram jord uppskattas innehålla mellan 107 – 109 prokaryota celler14. Dessutom, marklevande organismer är en huvudsaklig källa av romanen naturliga produkter, enzymer och antibiotika. Analys av DNA-sekvens i jord metagenomik utgör därmed, ett värdefullt pedagogiskt verktyg för studenter på varje utbildningsnivå. NS teknikens underlätta användning och låg kostnad gör detta system en mycket effektiv läromedel. Studenter kan sekvens miljöprover och efter slutförandet av sekvensen använda tillgängliga bioinformatiska verktyg att identifiera och karaktärisera mikrober och metagenomik sekvenser i proverna. Använda tekniken för NS, har studenter sanna praktisk erfarenhet, som har fram till nu varit av nå för användning i laboratorium kurser på grund av avancerad teknisk expertis och höga reagens, utrustning och underhåll kostnader i andra sekvensering plattformar. En av våra studenter (J. Harrison, personlig kommunikation) rapporterade nyligen, användningen av denna teknologi i ett miljöprojekt övervakning av gården jordar. Vi förväntar oss att det kommer att finnas många fler applikationer för denna teknik i utbildningen rymden.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt var stöd i del av Johns Hopkins University, Office av profossen genom den Gateway Science Initiative.
Thermal Cycler | LifeECO | BTC42096 | |
Covaris g-TUBE | Covaris | 520079 | |
NEBNext End Repair Module | New England BioLab | E7546 | |
Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLab | MO367 | |
MyOne C1 Strepavidin Beads | Thermo Fisher | 65001 | |
Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5420 | |
Nanodrop UV spectrophotometer | Thermo Fisher | ND-2000 | Model 2000 |
Belly Dancer Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | Z768499 | |
Power Soil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
Ligation Sequencing Kit 2D | Oxford Nanopore | SQK-LSK208 | |
Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | |
End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix) | New England BioLab | MO367 | |
AmPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Basic Starter Pack | Oxford Nanopore | Includes MinION Sequencing Device and Flow Cell | |
MinKNOW software | Oxford Nanopore | ||
Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA | Oxford Nanopore | SQK-RAD002 | Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB) |