Her presenterer vi en protokoll for å indusere lammelse og opticospinal betennelse av overføring av aquaporin-4 (AQP4)-spesifikke T-celler fra AQP4– / – mus i WT mus. I tillegg viser vi hvordan du bruker serielle optical coherence tomografi overvåke visuelle systemet dysfunksjon.
Mens det er anerkjent at aquaporin-4 (AQP4)-spesifikke T celler og antistoffer delta i patogenesen av neuromyelitis optica (NMO), en menneskelig sentralnervesystemet (CNS) autoimmune demyeliniserende sykdom, etableringen av en AQP4 målrettede modell med både klinisk og histologic manifestasjoner av CNS autoimmunitet har vist seg utfordrende. Immunisering av vill-type (WT) mus med AQP4 peptider vakte T celle spredning, selv om de T-cellene ikke kan overføre sykdom til naiv mottaker mus. Nylig ble to romanen AQP4 T celle epitopes, peptid (p) 135-153 og p201-220, identifisert når studere immunreaksjoner til AQP4 i AQP4-mangelfull (AQP4– / –) mus, tyder T celle reaktivitet til disse epitopes er vanligvis styrt av thymic negativ utvalg. AQP4– / – Th17 polarisert T celler primet å p135 153 eller p201-220 indusert lammelse i mottakerens WT mus, som var assosiert med overveiende leptomeningeal betennelse i ryggmargen og optiske nervene. Betennelse rundt optiske nervene og involvering av indre retinal lagene (IRL) ble manifestert ved endringer i seriell optical coherence tomografi (OCT). Her illustrere vi tilnærminger brukt til å lage denne nye i vivo modellen av AQP4 målrettede CNS autoimmunitet (ATCA), som kan nå brukes til å studere mekanismer som tillater utvikling av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T-celler og hvordan de kan samarbeide med B cellene i NMO patogenesen.
Neuromyelitis optica (NMO) er en sentralnervesystemet (CNS) autoimmune inflammatoriske demyeliniserende sykdom som forårsaker tilbakevendende episoder av lammelse og synstap fører til nevrologiske invaliditet1. NMO regnes tiden primært en humoral autoimmun sykdom2 som det er forbundet med antistoffer (Igs) rettet mot aquaporin-4 (AQP4), en vann kanal uttrykt rikelig på astrocyttene3,4. CNS betennelse er imidlertid en forutsetning for CNS oppføringen AQP4 Ig5,6. Dermed har det ikke vært mulig å etablere en modell av NMO ved overføring av anti-AQP4 Igs alene. Funnene at (1) sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke Igs i NMO pasienter er IgG11,2, en T celle-avhengige Ig underklasse7 (2) T-celler identifiseres i NMO lesjoner8,9 (3) NMO er tilknyttet med visse MHC-II gener (f.eks HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10og (4) proinflammatory AQP4-reaktive DR-begrenset Th17 celler er utvidet i NMO pasienter11,12 alle indikerer at AQP4-spesifikke T celler har en nøkkelrolle i NMO patogenesen. Derfor er det viktig å utvikle dyr modeller for å bestemme hvordan AQP4-spesifikke T celler kan bidra til NMO patogenesen.
Flere år siden, ble flere AQP4 T celle epitopes identifisert i vill-type (WT) mus13,14 og rotter15. Mens det ble observert at AQP4-reaktive T celler kan indusere opticospinal betennelse i naiv mottaker rotter15,16, var betydelig klinisk underskriver av CNS sykdom ikke observert. Tilsvarende direkte immunisering av WT mus med peptider som inneholder AQP4 T celle epitopes14,17, eller overføre proinflammatory T-celler som er rettet mot de determinanter17, ikke forårsake kliniske tegn eller histologic bevis på CNS autoimmunitet.
Nylig det ble observert at immunisering for C57BL/6 AQP4 dårlig (AQP4– / –) mus AQP4 peptid (p) 135-153 eller p201-220, to determinanter spådd for å binde MHC-II (enb) med høy affinitet18, vakte sterke CD4 + T celle svar17. Disse to peptider vakte derimot bare beskjeden proliferativ svar i WT mus. Videre var T-celle reseptor (TCR) repertoaret brukes for anerkjennelse av disse determinanter av T-celler fra AQP4– / – mus unik. Samlet viser disse funnene at T celle anerkjennelse av AQP4 er regulert av thymic negative utvalg. AQP4 p135-153 – eller p201-220-spesifikk Th17 celler fra AQP4– / – giver mus indusert lammelse i nesten 100% av naiv mottaker WT mus; Dette var tilknyttet opticospinal infiltrerer T celler og B-celler monocytter. Føljetong opticospinal coherence tomografi (OCT) vist dynamiske visuelle filsystemet. Mus med T celle-mediert AQP4 målrettede CNS autoimmunitet (ATCA) utvinnes fra lammelse og visuelle systemet skade. I motsetning til EAE indusert av myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) p35-55-spesifikke T celler, som førte til vedvarende klinisk sykdom, var ATCA av T-celler alene ikke tilknyttet axonal tap eller reduksjon i netthinnen ganglieceller (RGCs). Resultatene har vist at det er flere sykdomsfremkallende AQP4 T celle determinanter. Denne modellen av ATCA er nyttig for å studere mekanismer som styrer utviklingen av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T-celler, lære hvordan cellene indusere CNS betennelse og hvordan de kan samarbeide med AQP4-spesifikke B celler og antistoffer å fremme NMO patogenesen .
Nåværende rapporten beskriver vi protokollene som brukes til å indusere og evaluere T celle-indusert ATCA. Vi begynner med teknikkene som brukes for immunisering, T cellekultur og Th17 polarisering generere sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke T celler, flyt cytometri analyse å bekrefte polarisering og adopsjon overføring av disse T-celler. Vi beskriver metoder for å vurdere kliniske og histologic og bruk av føljetong OCT overvåke visuelle systemet skade i mottakerens mus.
AQP4 ble identifisert som den primære målet i NMO IgG i 20053. Da ble det kjent at det ville være viktig å etablere en AQP4 målrettede dyr modell av CNS autoimmunitet. Slik modell kan være nyttig å undersøke hvordan AQP4-spesifikke T- og B-cellene delta i utviklingen av CNS autoimmunitet og teste kandidat therapeutics for NMO. Selv om identifikasjonen av AQP4-spesifikke T celle epitopes i vill-type mus ble først rapportert i 201013, T-celler som svarer til de epitopes ikke forårsake klinisk eller histologic14,17. Manglende evne til å generere en modell av CNS autoimmunitet basert på immun reaktivitet til AQP4 forble et mysterium inntil 2015 når Jones, et al. 25 oppdaget at giver AQP4 p135-153-primet T celler fra AQP4– / – mus var kan forårsake klinisk og histologic tegn på CNS autoimmunitet i WT mus. Av interesse spådd AQP4 p135-153 for å binde MHC-II (enb) med høy affinitet17. Bare en annen AQP4 aminosyresekvens, 201-220, er spådd for å binde enb med lignende høy affinitet. Faktisk observerte vi at AQP4 p135-153 og p201-220 både framprovosere robust spredning i AQP4– / –, men ikke WT, mus. Her har vi vist hvordan man kan isolere og utvide encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 – og p201-220-reaktive T celler fra AQP4– / – mus. Når overført til WT mottaker mus, induserte donor AQP4-reaktive Th17 cellene lammelse, som ble ledsaget av mononukleære celle infiltrerer i ryggmargen og synsnerven. Afferente visuelle systemet skade er kjent hos pasienter med AQP4-avrusningsenhetene NMOSD26. Her observerte vi at synsnerven betennelse forårsaket av AQP4-reaktive og MOG-reaktive Th17 cellene var tydelig. Mens AQP4-spesifikke Th17 celler indusert fiberoptisk perineuritis, forårsaket MOG-spesifikke Th17 celler alvorlig optisk nevritt. Vi har også beskrevet teknikker brukes til å overvåke synsnerven betennelse forårsaket av AQP4-spesifikke og MOG-spesifikke T celler av føljetong OCT. Andre etterforskere skal nå kunne bruke protokollene beskrevet her for å fremme sine egne studier fokuserte på patogene mekanismer for ATCA.
Man kan lett unngå tre potensielle fallgruver i våre protokollen. Første, adopsjon overføring av ATCA krever AQP4-spesifikke T celler fra AQP4– / – giver mus. Spesielt forårsake giver WT AQP4 p135-153-spesifikke T celler ikke ATCA i mottakerens WT mus. Dernest er det viktig å utføre en “vann-test” med en dråpe peptid/CFA emulsjonen før immunisering av AQP4– / – mus (protokollen trinn 1.5). Emulsjonen bør ikke spre i vann når det passer for SC injeksjon. Hvis emulsjonen fordeler, bør en blande emulsjonen igjen, chill igjen og gjenta vann-testen. Til slutt indusere aktivert donor CNS antigen-spesifikke T celler CNS autoimmunitet mer effektivt enn hvile T celler. En bør visuelt undersøke disse kulturer under lys mikroskopet før høsting donor T celler for adopsjon overføring. Hurtig deler celler kan danne sektorgrupper, som er lett identifiseres. Også når kulturer inneholder mange aktivert T-celler, kan media overgangen fra rosa til oransje eller til gul, på grunn av reduksjon i pH. Man kan også vurdere aktivering av donor AQP4-primet lymfeknute T celler for spredning av 3H-thymidine innlemmelse, som beskrevet i protokollen trinn 3.
Våre funn at to sykdomsfremkallende AQP4 T celle epitopes er (1) spådd å binde MHC-II med høy affinitet og (2) framprovosere potente proliferativ reaksjoner i AQP4– / –, men ikke WT, mus tyder på at T-celler som er rettet mot disse determinants er normalt kontrollert av thymic negative utvalg17. TCR repertoar benyttes for anerkjennelse av AQP4 p135-153 og p201-220 i AQP4– / – mus er unik (figur 2), som er også i overensstemmelse med klonal sletting formidlet av thymic medullær epitelceller. Andre tolerogenic mekanismer kan vanligvis hindre immunreaksjoner til AQP4. Etter vårt første rapport17viste en annen gruppe også at AQP4 p201-220 inneholder en encephalitogenic T celle determinant27. Når α/β (TCRα– / –) T celle-mangelfull mus ble rekonstituert med AQP4– / – CD4+ T celler, det var mulig å lokke fram en encephalitogenic AQP4-spesifikke T celle respons, men ikke en AQP4-spesifikke humoral respons, noe som i WT mus AQP4-spesifikke B celle svar, analog med AQP4-spesifikke T celle svar, kan negative utvalg. Faktisk, tap av ryggmargen axons og RGCs, ble ikke registrert i WT mus med ATCA av AQP4-spesifikke T celler alene, kan kreve deltakelse av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke antistoffer. Det er klart at musen modeller av AQP4 målrettede CNS autoimmunitet vil fortsette å utvikle seg som vi lærer mer om de tolerogenic mekanismene som vanligvis styrer AQP4-spesifikke T-celler og B-celle immunitet.
Andre modeller av AQP4 målrettede CNS autoimmunitet blir også utviklet6,16,28,29,30. Hver og en kan gi fordeler for å undersøke bestemte aspekter som er relevante for NMO patogenesen. AQP4-spesifikke T celler har blitt identifisert i WT rotter6,16,29. AQP4-spesifikke T celler forårsaket histologic endringer i CNS autoimmunitet, men ligner observasjoner i mus, WT rotte AQP4-spesifikke T celler forårsaker ikke betydelig underskriver av kliniske sykdommen. Mekanismer for toleranse begrenser T-celler og B-celle AQP4-spesifikke immunreaksjoner i WT mus er derfor også i rotter. Uansett, bør en ikke undervurdere kraften i å bruke musen modeller for å studere mekanismer involvert i patogenesen av sykdom. Vell av knock-out, transgene og reporter mus kan være fordelaktig. Det bør også anerkjent at flere grunnleggende funn i autoimmunitet ble gjort ved hjelp av musen EAE modeller. For eksempel demonstrasjon T cellen kloner bestemt en selv-antigen kan megle autoimmun sykdom31,32, identifikasjon av rollen T celle costimulation autoimmunitet33 og oppdagelsen av den utviklingsmessige veien for Th17 differensiering34 ble først beskrevet ved hjelp av musen EAE modeller. Bruker musemodell av ATCA som vi har utviklet, har en nå har midler til å studere utviklingen og regulering av sykdomsfremkallende AQP4-spesifikke immunreaksjoner i vivo, som skal gi viktig innsikt knyttet til NMO patogenesen.
The authors have nothing to disclose.
Støtte ble gitt til S.S.Z. av National Institute of Health (RO1 AI073737 og RO1 NS092835-01), nasjonal multippel sklerose samfunnet (RG 4768, RG 5179 og RG 5180), Maisin Foundation og Guthy Jackson veldedige Foundation.
M. tuberculosis H37Ra | BD Difco | 231141 | Dessicated, killed M. tuberculosis |
Incomplete Freund's Adjuvant | BD Difco | 263910 | |
AQP4 peptide p135-153 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN |
AQP4 peptide p201-220 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP |
MOG peptide p35-55 | Genemed / Auspep | Custom Synthesis | Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
3-way Stopcock | Kimble | 420163-4503 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071 | |
Recombinant Mouse IL-23 | R&D Systems (BioTechne) | 1887-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D Systems (BioTechne) | 406-ML | |
Recombinant Mouse IL-12 | R&D Systems (BioTechne) | 419-ML | |
Thymidine [Methyl-3H] | PerkinElmer | NET027 | |
Glass Fiber Filtermats | PerkinElmer | 1450-421 | |
Anti-mouse antibodies | eBioscience (Affymetrix) | [various] | |
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel | BD Biosciences | 557004 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain | ThermoFisher Scientific | [various] | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Iomomycin (calcium salt) | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Pertussis Toxin from B. pertussis | List Biological Laboratories | 181 | |
10% Formalin | VWR | 89370-094 | |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | |
Foam Biopsy Pads, Rectangular | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Isothesia (isoflurane, USP) | Henry Schein Animal Health | 050033 | NDC : 11695-0500-2 |
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Akorn | NDC: 17478-102-12 | |
Spectralis Diagnostic Imaging Platform | Heidelberg Engineering |