Vi præsenterer her, en protokol for at fremkalde lammelser og opticospinal betændelse af overførsel af aquaporin-4 (AQP4)-specifikke T-celler fra AQP4– / – mus til WT mus. Derudover viser vi hvordan serie optisk kohærens tomografi til at overvåge visuelle system dysfunktion.
Mens det er anerkendt at aquaporin-4 (AQP4)-specifikke T-celler og antistoffer deltage i patogenesen af neuromyelitis optica, (NMO), en menneskelig centralnervesystemet (CNS) autoimmune demyeliniserende sygdom, oprettelsen af en AQP4-målrettet model med både klinisk og histologisk manifestationer af CNS autoimmunitet har bevist udfordrende. Immunisering af wild-type (WT) mus med AQP4 peptider fremkaldte T celleproliferation, selv om T cellerne ikke kunne overføre sygdommen naive recipient mus. For nylig, to roman AQP4 T celle epitoper, peptid (p) 135-153 og p201-220, blev identificeret ved at studere immunrespons til AQP4 i AQP4-mangel (AQP4– / –) mus, hvilket tyder på T-celle reaktivitet til disse epitoper styres normalt af thymic negative valg. AQP4– / – Th17 polariseret T celler primet til enten p135-153 eller p201-220 induceret lammelse i modtagerens WT mus, der var forbundet med overvejende leptomeningeal betændelse af rygmarv og synsnerverne. Betændelse omkringliggende synsnerverne og inddragelse af de indre nethinde lag (IRL) blev manifesteret ved ændringer i serie optisk kohærens tomografi (OCT). Her, illustrere vi metoderne bruges til at oprette denne nye i vivo model af AQP4-målrettet CNS autoimmunitet (ATCA), som kan nu anvendes til at studere mekanismer, der tillader udviklingen af patogene AQP4-specifikke T-celler og hvordan de kan samarbejde med B celler i NMO patogenese.
Neuromyelitis optica, (NMO) er en centralnervesystemet (CNS) autoimmune inflammatorisk demyeliniserende sygdom, der forårsager tilbagevendende episoder af lammelse og visuelle tab fører til permanent neurologiske handicap1. NMO anses i øjeblikket primært at være en lun autoimmun sygdom2 , da det er forbundet med antistoffer (Igs) målretning aquaporin-4 (AQP4), en vand kanal udtrykt rigeligt på astrocytter3,4. CNS betændelse er imidlertid en forudsætning for CNS indtastning af AQP4 Ig5,6. Således har det ikke været muligt at etablere en model af NMO ved overførsel af anti-AQP4 Igs alene. Resultaterne at (1) patogene AQP4-specifikke Igs i NMO patienter er IgG11,2, en T-celle-afhængige Ig underklasse7 (2) T celler er identificeret i NMO læsioner8,9 (3) NMO er forbundet med visse MHC II gener (fx HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, og (4) proinflammatoriske AQP4-reaktiv DR-begrænset Th17 celler er udvidet i NMO patienter11,12 alle viser, at AQP4-specifikke T-celler har en nøglerolle i NMO patogenese. Det er således vigtigt at udvikle dyremodeller for at afgøre, hvordan AQP4-specifikke T-celler kan bidrage til NMO patogenese.
Flere år siden, blev flere AQP4 T celle epitoper identificeret i wild-type (WT) mus13,14 og rotter15. Mens det blev observeret, at AQP4-reaktiv T celler kan inducere opticospinal inflammation i naive modtager rotter15,16, blev betydelig klinisk tegn på CNS sygdom ikke overholdt. På samme måde direkte immunisering af WT mus med peptider indeholdende AQP4 T celle epitoper14,17, eller overførsel af proinflammatoriske T-celler rettet mod disse determinanter17, ikke forårsage kliniske tegn eller histologiske dokumentation af CNS autoimmunitet.
For nylig, det blev observeret at immunisering af C57BL/6 AQP4-mangel (AQP4– / –) mus med AQP4 peptid (p) 135-153 eller p201-220, to determinanter forudsagt for at binde MHC II (-Ab) med høj affinitet18, fremkaldte stærke CD4 + T-celle svar17. Derimod fremkaldte disse to peptider kun beskedne proliferativ svar i WT mus. Yderligere, T-celle receptoren (TCR) repertoire bruges til anerkendelse af disse determinanter af T-celler fra AQP4– / – mus var enestående. Kollektivt, viser disse resultater, at T-celle anerkendelse af AQP4 er reguleret af thymic negative valg. AQP4 p135-153 – eller p201-220-specifikke Th17 celler fra AQP4– / – donor mus induceret lammelse i næsten 100% af naive modtager WT mus; Det var forbundet med opticospinal infiltrater af T-celler, B-celler og monocytter. Seriel opticospinal kohærens tomografi (OCT) påvist dynamiske visuelle system inddragelse. Mus med T-celle-medieret AQP4-målrettet CNS autoimmunitet (ATCA) inddrives fra lammelse og visuelle system skade. I modsætning til EAE induceret af myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) p35-55-specifikke T-celler, hvilket førte til vedvarende klinisk sygdom, var ATCA induceret af T-celler alene ikke forbundet med cytoskeletale tab eller reduktion af retinal ganglion celler (RGCs). Vores resultater har klart vist, at der er flere patogene AQP4 T celle determinanter. Denne nye model af ATCA er nyttigt for at studere mekanismer styrer udviklingen af patogene AQP4-specifikke T-celler, lære hvordan disse celler inducerer CNS betændelse og hvordan de kan samarbejde med AQP4-specifikke B-celler og antistoffer til at fremme NMO patogenese .
I den foreliggende betænkning beskriver vi de protokoller, der bruges til at fremkalde og evaluere T-celle-induceret ATCA. Vi begynder med de teknikker, der anvendes for immunisering, T-cellekultur og Th17 polarisering for at generere patogene AQP4-specifikke T-celler flow flowcytometri analyse at bekræfte polarisering og adoptiv overførsel af disse T-celler. Vi derefter beskrive metoder, der anvendes til at vurdere klinisk og histologisk sygdom og brug af serielle OLT til at overvåge visuelle system skade i modtagerens mus.
AQP4 blev identificeret som det primære mål i NMO IgG i 20053. Derefter blev det anerkendt at det ville være vigtigt at etablere en AQP4-målrettet dyremodel af CNS autoimmunitet. Sådan en model kunne være nyttigt at undersøge, hvordan AQP4-specifikke T- og B-cellerne deltage i udviklingen af CNS autoimmunitet og at teste kandidat therapeutics for NMO. Selv om identifikation af AQP4-specifikke T celle epitoper i wild-type mus blev først rapporteret i 201013, T celler reagerer på disse epitoper ikke forårsage sygdom kliniske eller histologiske14,17. Manglende evne til at generere en model af CNS autoimmunitet baseret på immun reaktivitet til AQP4 forblev en gåde indtil 2015 når Jones, et al. 25 opdagede, at donor AQP4 p135-153-pulverlak T celler fra AQP4– / – mus var i stand til at forårsage klinisk og histologisk tegn på CNS autoimmunitet i WT mus. Af interesse, er AQP4 p135-153 forudsagt til at binde MHC II (-Ab) med høj affinitet17. Kun én anden AQP4 aminosyresekvens, 201-220, er forudsagt til at binde-Ab med lignende høj affinitet. Tværtimod konstaterede vi, at AQP4 p135-153 og p201-220 begge fremkalde robust spredning i AQP4– / –, men ikke WT, mus. Her har vi vist hvordan man kan isolere og udvide encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 – og p201-220-reaktiv T celler fra AQP4– / – mus. Når overført til WT recipient mus, inducerede donor AQP4-reaktive Th17 celler lammelse, som var ledsaget af mononukleære celler infiltrater i rygmarven og synsnerven. Afferente visuelle system skade er velkendt hos patienter med AQP4-seropositive NMOSD26. Her, observerede vi, synsnerven betændelse fremkaldt af AQP4-reaktive og MOG-reaktive Th17 celler var adskilte. AQP4-specifikke Th17 celler fremkaldte fiberoptisk perineuritis, inducerede MOG-specifikke Th17 celler svær synsnervebetændelse. Vi har også beskrevet de teknikker, der anvendes til at overvåge synsnerven betændelse fremkaldt af AQP4-specifikke og MOG-specifikke T celler OLT-serie. Andre efterforskere bør nu være i stand til at anvende de protokoller er beskrevet her for at fremme deres egne undersøgelser fokuseret på patogene mekanismer af ATCA.
Man kan nemt undgå tre potentielle faldgruber i vores protokol. Første, adoptiv overførsel af ATCA kræver brug af AQP4-specifikke T-celler fra AQP4– / – donor mus. Specifikt, donor WT AQP4 p135-153-specifikke T celler ikke forårsage ATCA i modtagerens WT mus. For det andet er det vigtigt at udføre en “vand-test” med en dråbe af peptid/CFA emulsion før immunisering af AQP4– / – mus (protokol trin 1,5). Emulsion bør ikke sprede i vand, når det er egnet til s.c. injektion. Hvis emulsion spreder, bør en Bland emulsion endnu, chill igen og Gentag vand-test. Endelig inducerer aktiveret donor CNS antigen-specifikke T-celler CNS autoimmunitet mere effektivt end hvile T-celler. Man bør visuelt inspicere disse kulturer under lysmikroskop før høst donor T celler for adoptiv overførsel. Hurtigt dividere celler kan danne klynger, som let kan identificeres. Også, når kulturer indeholder mange aktiverede T-celler, medierne kan overgang fra pink orange eller gul, på grund af fald i pH. Man kan også vurdere aktivering af donor AQP4-pulverlak lymfeknude T celler for spredning af 3H-thymidine vedtægter, som beskrevet i protokollen trin 3.
Vores opdagelse at de to patogene AQP4 T celle epitoper (1) forventes at binde MHC II med høj affinitet og (2) fremkalde potent proliferativ svar i AQP4– / –, men ikke WT, mus tyder på, at T-celler rettet mod disse determinanter er normalt kontrolleret af thymic negative valg17. De TCR repertoirer udnyttet for anerkendelse af AQP4 p135-153 og p201-220 i AQP4– / – mus er unikke (figur 2), som er også i overensstemmelse med klonede sletning medieret af thymic medullær epitelceller. Andre tolerogenic mekanismer kan normalt dy immunrespons til AQP4. Efter vores første rapport17viste en anden gruppe også, at AQP4 p201-220 indeholder en encephalitogenic T-celle determinant27. Hvornår α/β (TCRα– / –) T-celle-mangelfuld mus var rekonstitueres med AQP4– / – CD4+ T celler, det var muligt at fremkalde en encephalitogenic AQP4-specifikke T-celle respons, men ikke en AQP4-specifikke humorale respons, hvilket indebærer, at der i WT mus AQP4-specifikke B-celle svar, svarende til AQP4-specifikke T-celle svar, er omfattet af negative valg. Faktisk kan tab af rygmarven axoner og RGCs, der ikke blev observeret i WT mus med ATCA induceret af AQP4-specifikke T-celler alene, kræve deltagelse af patogene AQP4-specifikke antistoffer. Det er klart, at musemodeller af AQP4-målrettet CNS autoimmunitet fortsat vil udvikle sig som vi lærer mere om de tolerogenic mekanismer normalt kontrollere AQP4-specifikke T celler og B-celle immunitet.
Andre modeller af AQP4-målrettet CNS autoimmunitet er også ved at blive udviklet6,16,28,29,30. Hver enkelt kan tilbyde fordele for at studere særlige aspekter, der er relevante for NMO patogenese. AQP4-specifikke T-celler er blevet identificeret i WT rotter6,16,29. Disse AQP4-specifikke T-celler forårsaget histologiske ændringer af CNS autoimmunitet, men ligner observationer i mus, WT rotte AQP4-specifikke T-celler forårsager ikke betydelig kliniske sygdomstegn. Mekanismer af tolerance begrænser T celler og B-celle AQP4-specifikke immunrespons i WT mus er derfor også operationelle i rotter. Uanset hvad, bør man ikke undervurdere magten i brug af musemodeller for at studere mekanismer involveret i patogenesen af sygdommen. Rigdommen af knock-out, transgene og reporter mus kan være en fordel. Det bør også anerkendes, at flere grundlæggende opdagelser i autoimmunitet blev foretaget ved hjælp af musen EAE modeller. For eksempel, demonstration at T celle kloner specifikke for en self-antigen kan mægle autoimmun sygdom31,32, identifikation af T-celle costimulation i autoimmunitet33 rolle og opdagelsen af den udviklingsmæssige pathway for Th17 differentiering34 blev først beskrevet ved hjælp af musen EAE modeller. Ved hjælp af ATCA, som vi har udviklet musemodel, har man nu mulighed for at studere udvikling og regulering af patogene AQP4-specifikke immunrespons in vivo, som bør give vigtig indsigt vedrører NMO patogenese.
The authors have nothing to disclose.
Blev ydet støtte til S.S.Z. af National Institute of Health (RO1 AI073737 og RO1 NS092835-01), National dissemineret sklerose samfundet (RG 4768, RG 5179 og RG 5180), Maisin Foundation og Guthy Jackson velgørenhedsfond.
M. tuberculosis H37Ra | BD Difco | 231141 | Dessicated, killed M. tuberculosis |
Incomplete Freund's Adjuvant | BD Difco | 263910 | |
AQP4 peptide p135-153 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN |
AQP4 peptide p201-220 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP |
MOG peptide p35-55 | Genemed / Auspep | Custom Synthesis | Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
3-way Stopcock | Kimble | 420163-4503 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071 | |
Recombinant Mouse IL-23 | R&D Systems (BioTechne) | 1887-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D Systems (BioTechne) | 406-ML | |
Recombinant Mouse IL-12 | R&D Systems (BioTechne) | 419-ML | |
Thymidine [Methyl-3H] | PerkinElmer | NET027 | |
Glass Fiber Filtermats | PerkinElmer | 1450-421 | |
Anti-mouse antibodies | eBioscience (Affymetrix) | [various] | |
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel | BD Biosciences | 557004 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain | ThermoFisher Scientific | [various] | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Iomomycin (calcium salt) | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Pertussis Toxin from B. pertussis | List Biological Laboratories | 181 | |
10% Formalin | VWR | 89370-094 | |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | |
Foam Biopsy Pads, Rectangular | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Isothesia (isoflurane, USP) | Henry Schein Animal Health | 050033 | NDC : 11695-0500-2 |
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Akorn | NDC: 17478-102-12 | |
Spectralis Diagnostic Imaging Platform | Heidelberg Engineering |