Här presenterar vi ett protokoll för att inducera förlamning och opticospinal inflammation genom överföring av akvaporin-4 (AQP4)-specifika T-celler från AQP4– / – mössen i WT möss. Dessutom visar vi hur du använder seriell optisk koherenstomografi för att övervaka visuella systemet dysfunktion.
Medan det är erkänt att akvaporin-4 (AQP4)-specifika T-celler och antikroppar delta i patogenesen av neuromyelitis optica (NMO), människans centrala nervsystem (CNS) autoimmun demyeliniserande sjukdom, skapandet av en AQP4-riktade modell med både klinisk och histologisk manifestationer av CNS autoimmunitet har visat sig vara utmanande. Immunisering av vildtyp (WT) möss med AQP4 peptider framkallade T cell spridning, även om dessa T-celler inte kan överföra sjukdomen till naiva mottagarens möss. Nyligen har identifierades två roman AQP4 T cell epitoper, peptid (p) 135-153 och p201-220, när studera immunsvaret för AQP4 i AQP4-brist (AQP4– / –) möss, vilket tyder på T-cellsreaktivitet till dessa epitoper styrs normalt av thymic negativa urval. AQP4– / – Th17 polariserade T-celler som primärvaccinerats till antingen p135-153 eller p201-220 inducerad förlamning i mottagarens WT möss, som associerades med huvudsakligen leptomeningeal inflammation i ryggmärgen och synnerver. Inflammation omgivande synnerverna och engagemang av inre retinala lagren (IRL) var manifesteras av förändringar i seriell optisk koherenstomografi (OCT). Här, illustrera vi de metoder som används för att skapa denna nya in-vivo -modell av AQP4 riktade CNS autoimmunitet (ATCA), som nu kan användas för att studera mekanismer som tillåter utvecklingen av patogena AQP4-specifika T-celler och hur de kan samarbeta med B celler i NMO patogenes.
Neuromyelitis optica (NMO) är en centrala nervsystemet (CNS) autoimmuna inflammatoriska demyeliniserande sjukdom som orsakar återkommande episoder av förlamning och visuell förlust leder till permanenta neurologiska funktionshinder1. NMO anses för närvarande främst vara en humorala autoimmun sjukdom2 eftersom det är associerade med antikroppar (Igs) inriktning akvaporin-4 (AQP4), en vattenkanal uttryckt rikligt på astrocyterna3,4. CNS inflammation är dock en förutsättning för CNS inmatning av AQP4 Ig5,6. Således har det inte varit möjligt att fastställa en modell av NMO genom överföring av anti-AQP4 Igs ensam. Resultaten att (1) patogena AQP4-specifika Igs NMO patienter är IgG11,2, en T-cell-beroende Ig underklass7 (2) T-celler påvisas i NMO lesioner8,9 (3) NMO är associerad med vissa MHC II gener (e.g. HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10och (4) proinflammatoriska AQP4-reaktivt DR-begränsad Th17 celler byggs i NMO patienter11,12 alla indikerar att AQP4-specifika T-celler har en nyckelroll i NMO patogenes. Därför är det viktigt att utveckla modeller för att avgöra hur AQP4-specifika T-celler kan bidra till NMO patogenes.
Flera år sedan, identifierades flera AQP4 T cell epitoper i vildtyp (WT) möss13,14 och råttor15. Samtidigt konstaterades att AQP4-reaktiva T-celler kan inducera opticospinal inflammation i naiva mottagarens råttor15,16, observerades inte betydande kliniska tecken på CNS-sjukdomar. På samma sätt direkt immunisering av WT möss med peptider som innehåller AQP4 T cell epitoper14,17, eller överföring av proinflammatoriska T celler inriktning dessa bestämningsfaktorer17, inte orsakar kliniska tecken eller histologisk tecken på CNS autoimmunitet.
Nyligen det observerades att immunisering av C57BL/6 AQP4-brist (AQP4– / –) möss med AQP4 peptid (p) 135-153 eller p201-220, två determinanter förutspådde för att binda MHC II (I-Ab) med hög affinitet18, framkallade starka CD4 + T-cell svar17. Dessa två peptider framkallade däremot endast blygsamma proliferativ svaren i WT möss. Ytterligare, T-cell receptor (TCR) repertoaren används för erkännande av dessa bestämningsfaktorer av T-celler från AQP4– / – möss var unik. Sammantaget tyder dessa fynd att T cell erkännande av AQP4 regleras i thymic negativa urval. AQP4 p135-153 – eller p201-220-specifika Th17-celler från AQP4– / – givare möss inducerad förlamning i nästan 100% av naiva mottagarens WT möss; Detta var associerade med opticospinal infiltrat av T-celler, B-celler och monocyter. Seriella opticospinal koherenstomografi (OCT) visat dynamiska visuella systemet engagemang. Möss med T-cell-medierad AQP4-riktade CNS autoimmunitet (ATCA) återhämtat sig från förlamning och visuella systemet skada. I motsats till EAE orsakas av myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) p35-55-specifika T-celler, som ledde till ihållande klinisk sjukdom, förknippades ATCA induceras av T-celler ensam inte med axonal förlust eller minskning av retinala ganglionceller (RGCs). Våra resultat har tydligt visat att det finns flera patogena AQP4 T cell bestämningsfaktorer. Denna nya modell av ATCA är användbar för att studera mekanismer som styr utvecklingen av patogena AQP4-specifika T-celler, lära sig hur dessa celler inducerar CNS inflammation och hur de kan samarbeta med AQP4-specifika B-celler och antikroppar att främja NMO patogenes .
I det föreliggande betänkandet beskriver vi de protokoll som används för att inducera och utvärdera T cell-inducerad ATCA. Vi börjar med de tekniker som används för immunisering, T cellkultur och Th17 polarisering för att generera patogena AQP4-specifika T-celler, flödescytometri Flödesanalys att bekräfta polarisering och överföring av dessa T-celler. Sedan beskriver vi metoder för att utvärdera klinisk och histologisk sjukdom och användning av seriell OCT att övervaka visuella systemet skada i mottagarens möss.
AQP4 identifierades som det primära målet i NMO IgG i 20053. Sedan kändes det som att det skulle vara viktigt att upprätta en AQP4-riktade djurmodell av CNS autoimmunitet. En sådan modell kan vara användbart att undersöka hur AQP4-specifika T och B celler deltar i utveckling av CNS autoimmunitet och testa kandidat therapeutics för NMO. Även om identifiering av AQP4-specifika T-cell epitoper i vildtyp möss rapporterades först i 201013, T-celler som svarar på dessa epitoper inte orsaka klinisk eller histologisk sjukdom14,17. Oförmåga att skapa en modell av CNS autoimmunitet utifrån immun reaktivitet till AQP4 förblev en gåta fram till 2015 när Jones, et al. 25 upptäckte att givaren AQP4 p135-153-primade T-celler från AQP4– / – möss kunde orsakar kliniska och histologiska tecken på CNS autoimmunitet i WT möss. Av intresse förutspås AQP4 p135-153 för att binda MHC II (I-Ab) med hög affinitet17. Endast en andra AQP4 amino syra ordnar, 201-220, förutspås för att binda I-Ab med liknande hög affinitet. Faktiskt, vi konstaterade att AQP4 p135-153 och p201-220 båda framkalla robust spridning i AQP4– / –, men inte WT, möss. Här har vi visat hur man kan isolera och expandera encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 – och p201-220-reaktiva T-celler från AQP4– / – möss. När överförs till WT mottagarens möss, inducerad givare AQP4-reaktivt Th17-celler förlamning, som åtföljdes av Mononukleära cellinfiltrat i ryggmärgen och synnerven. Afferenta visuella systemet skada är väl känt hos patienter med AQP4-seropositiva NMOSD26. Här, observerat vi att synnerven inflammation framkallas av AQP4-reaktivt och MOG-reaktivt Th17 celler var tydlig. Medan AQP4-specifika Th17-celler inducerad optisk perineuritis, inducerad MOG-specifika Th17-celler svår optikusneurit. Vi har också beskrivit de tekniker som används för att övervaka synnerven inflammation framkallas av AQP4-specifika och MOG-specifika T-celler med seriell OCT. Andra utredare bör nu kunna tillämpa de protokoll som beskrivs här för att föra fram sina egna studier som fokuserade på patogena mekanismer för ATCA.
Man kan enkelt undvika tre potentiella fallgropar i våra protokoll. Första, adoptiv överföring av ATCA kräver användning av AQP4-specifika T-celler från AQP4– / – givare möss. Specifikt, orsaka givare WT AQP4 p135-153-specifika T-celler inte ATCA i mottagarens WT möss. För det andra är det viktigt att utföra en ”vatten-test” med en droppe av peptid/CFA emulsionen före immunisering av AQP4– / – möss (protokoll steg 1,5). Emulsionen bör inte skingra i vatten när det är lämpligt för s.c. injektion. Om emulsionen skingrar, bör man blanda emulsionen gång, chill igen och upprepa vatten-testet. Slutligen inducerar aktiveras givare CNS antigen-specifika T-celler CNS autoimmunitet mer effektivt än vilar T-celler. En bör inspektera dessa kulturer under mikroskopet ljus före skörd givare T-cellerna för överföring. Snabbt delande celler kan bilda kluster, som är lätt identifieras. Också, när kulturer innehåller många aktiverade T-celler, media kan övergång från rosa till orange eller till gult, på grund av sänkning av pH. Man kan också bedöma aktivering av givare AQP4-primade lymfkörtel T celler för spridning av 3H-tymidin införlivande, som beskrivs i protokollet steg 3.
Vår upptäckt att de två patogena AQP4 T cell epitoper är (1) förutspådde att binda MHC II med hög affinitet och (2) framkalla potenta proliferativ svar i AQP4– / –, men inte WT, möss tyder på att T-celler som inriktning dessa bestämningsfaktorer är normalt kontrolleras av thymic negativa urval17. TCR repertoarer utnyttjas för erkännande av AQP4 p135-153 och p201-220 i AQP4– / – möss är unik (figur 2), vilket är också förenligt med klonal deletion medieras av thymic medullär epitelceller. Andra tolerogena mekanismer kan normalt avhålla immun Svaren till AQP4. Efter vår första rapport17visat en annan grupp också att AQP4 p201-220 innehåller en encephalitogenic T cell avgörande27. När α/β (TCRα– / –) T-cell-brist möss var rekonstitueras med AQP4– / – CD4+ T celler, var det möjligt att framkalla ett encephalitogenic AQP4-specifika T-cellssvar, men inte en AQP4-specifika humorala svar, vilket innebär att i WT möss AQP4-specifika B-cell svaren, liknar AQP4-specifika T-cell svar, är föremål för negativa urval. Förlust av ryggmärgen axoner och RGCs, som inte observerades i WT möss med ATCA inducerad av AQP4-specifika T-celler som är ensam, kan faktiskt kräva deltagande av patogena AQP4-specifika antikroppar. Det är tydligt att mus-modeller av AQP4 riktade CNS autoimmunitet kommer att fortsätta att utvecklas när vi lär oss mer om de tolerogena mekanismer som normalt styr AQP4-specifika T-celler och B-cell immunitet.
Andra modeller av AQP4 riktade CNS autoimmunitet pågår också utvecklade6,16,28,29,30. Var och en kan erbjuda fördelar för att studera särskilda aspekter som är relevanta för NMO patogenes. AQP4-specifika T-celler har identifierats i WT råttor6,16,29. Dessa AQP4-specifika T-celler orsakade histologiska förändringar i CNS autoimmunitet men liknar observationer i möss, WT råtta AQP4-specifika T-celler orsakar inte betydande tecken på klinisk sjukdom. Mekanismerna för tolerans begränsar T cell och B cell AQP4-specifika immunsvar i WT möss är därför också operativa hos råttor. Oavsett, bör man inte underskatta kraften i att använda musmodeller för att studera mekanismer som är involverade i patogenesen av sjukdomen. Rikedomen av knock-out, transgena och reporter möss kan vara fördelaktigt. Det bör också erkännas att flera grundläggande upptäckter i autoimmunitet har gjorts med hjälp av musen EAE modeller. Till exempel demonstration att T cell kloner som är specifika för ett self-antigen kan medla autoimmun sjukdom31,32, identifiering av rollen av T-cell costimulation i autoimmunitet33 och upptäckten av den utvecklings väg för Th17 differentiering34 beskrevs först med hjälp av musen EAE modeller. Använda musmodell av ATCA som vi har utvecklat, har en nu möjlighet att studera utveckling och reglering av patogena AQP4-specifika immunsvar in vivo som bör ge viktiga insikter relaterade till NMO patogenes.
The authors have nothing to disclose.
Stöd gavs till S.S.Z. av National Institute of Health (RO1 AI073737 och RO1 NS092835-01), nationell multipelskleros samfund (RG 4768, RG 5179 och RG 5180), Maisin Foundation och Guthy Jackson Charitable Foundation.
M. tuberculosis H37Ra | BD Difco | 231141 | Dessicated, killed M. tuberculosis |
Incomplete Freund's Adjuvant | BD Difco | 263910 | |
AQP4 peptide p135-153 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN |
AQP4 peptide p201-220 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP |
MOG peptide p35-55 | Genemed / Auspep | Custom Synthesis | Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
3-way Stopcock | Kimble | 420163-4503 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071 | |
Recombinant Mouse IL-23 | R&D Systems (BioTechne) | 1887-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D Systems (BioTechne) | 406-ML | |
Recombinant Mouse IL-12 | R&D Systems (BioTechne) | 419-ML | |
Thymidine [Methyl-3H] | PerkinElmer | NET027 | |
Glass Fiber Filtermats | PerkinElmer | 1450-421 | |
Anti-mouse antibodies | eBioscience (Affymetrix) | [various] | |
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel | BD Biosciences | 557004 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain | ThermoFisher Scientific | [various] | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Iomomycin (calcium salt) | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Pertussis Toxin from B. pertussis | List Biological Laboratories | 181 | |
10% Formalin | VWR | 89370-094 | |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | |
Foam Biopsy Pads, Rectangular | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Isothesia (isoflurane, USP) | Henry Schein Animal Health | 050033 | NDC : 11695-0500-2 |
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Akorn | NDC: 17478-102-12 | |
Spectralis Diagnostic Imaging Platform | Heidelberg Engineering |