Burada, felç ve opticospinal iltihap transfer aquaporin-4 (AQP4) tarafından ikna etmek için bir iletişim kuralı mevcut-WT fareler içine AQP4– / – fareler belirli T hücrelerden. Buna ek olarak, seri optik Koherens tomografi görsel sistem disfonksiyon izlemek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Bu tanınır iken o aquaporin-4 (AQP4)-Nöromyelitis optica (NMO), insan sinir sistemi (MSS) otoimmün demiyelinizan hastalık, her ikisi ile bir AQP4 hedefli modeli oluşturulması patogenezinde katılmak belirli T hücreleri ve antikorlar klinik ve histolojik CNS otoimmünite bulguları zorlu kanıtladı. Her ne kadar bu T hücreleri saf alıcı fareler için hastalık aktaramadı bağışıklama vahşi-tipi (WT) fare ile AQP4 peptidler T hücre çoğalması, elde edildi. Son zamanlarda, iki roman AQP4 T hücre epitopları, peptid (p) 135-153 ve p201-220, tespit edildi zaman immün yanıt-e doğru AQP4 T hücre reaktivite bu epitopları için öne AQP4-eksik (AQP4– / –) farelerde eğitim normalde timik tarafından denetlenir negatif seçim. AQP4– / – Th17 ağırlıklı olarak leptomeningeal iltihabı spinal kord ve görme sinirini ile ilişkili p135-153 veya p201-220 bağlı felç alıcı WT farelerde için astarlanmalıdır T hücreleri polarize. İltihabı çevreleyen görme sinirini ve iç retina katmanları (IRL) katılımı değişikliklerden seri optik Koherens tomografi (OCT) tecelli edildi. Burada, şimdi patojen AQP4 özgü T hücreleri ve nasıl onlar B ile işbirliği izin mekanizmaları incelemek için istihdam edilecek AQP4 hedefli CNS otoimmünite (ATCA), bu yeni vivo içinde model oluşturmak için kullanılan yaklaşımlar göstermek hücreleri NMO patogenezinde.
Nöromyelitis optica (NMO) felç ve görme kaybı kalıcı nörolojik özürlülük1‘ e giden tekrarlayan bölüm oluşmasına neden olan bir merkezi sinir sistemi (MSS) otoimmün inflamatuvar demiyelinizan hastalıktır. NMO şu anda aquaporin-4 (AQP4), bol bol astrocytes3,4üzerinde ifade bir su kanalı hedefleme antikorlar (IGS) ile ilişkili olduğu gibi öncelikle humoral Otoimmün hastalık2 olarak kabul edilir. Ancak, CNS iltihap AQP4 IG5,6CNS giriş için bir önkoşuldur. Böylece, NMO anti-AQP4 IGS yalnız transferi ile bir model kurmak mümkün olmamıştır. (1) patojen AQP4 özgü IGS NMO hastalarda Igg11,2vardır bulguların, alt sınıf7 (2) T hücreleri NMO lezyonlar8,9 ‘ (3) NMO tanımlanan bir T hücre bağımlı IG ilişkilidir bazı MHC II genler ile (örneğin HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10ve (4) proinflamatuar AQP4 reaktif DR-kısıtlı Th17 hücreleri NMO hastalar11,12 ‘ tüm genişletilmiş belirtmek AQP4 özgü T hücreleri önemli bir rol var NMO patogenezinde. Böylece, nasıl AQP4 özgü T hücreleri NMO patogenezinde katkıda bulunabilir belirlemek için hayvan modelleri geliştirmek önemlidir.
Birkaç yıl önce birden fazla AQP4 T hücre epitopları vahşi-tipi (WT) fareler13,14 ve fareler15‘ te tespit edilmiştir. AQP4-reaktif T hücreleri saf alıcı fareler15,16opticospinal iltihap neden gözlendi iken, CNS hastalığı önemli klinik belirtileri gözlenen değil. Benzer şekilde, doğrudan aşılama WT farelerin AQP4 T hücre epitopları14,17, içeren peptidler ile veya aktarım bu belirleyicileri17hedefleme proinflamatuar T hücrelerinin, klinik belirtiler neden olmaz veya histolojik CNS otoimmünite kanıtı.
Son zamanlarda, o bağışıklama C57BL/6 AQP4-eksik (AQP4– / –) fare ile AQP4 peptid (p) 135-153 ya da p201-220, iki belirleyicileri MHC II (ı-Ab) bağlamak için öngörülen yüksek afinite18ile gözlenmiştir, güçlü CD4 elde edildi + T hücre yanıt-e doğru17. Buna ek olarak, bu iki peptidler sadece mütevazı proliferatif yanıtları WT farelerde elde edildi. Ayrıca, bu belirleyici AQP4– / – fareler T hücreleri tarafından tanınması için kullanılan T hücre reseptör (TCR) repertuar benzersiz. Toplu olarak, bu bulgular AQP4 T hücre tanıma timik negatif seçime göre düzenlenmiştir göstermektedir. AQP4 p135-153 veya p201-220-özel AQP4– / – donör fareler hücrelerden Th17 neredeyse % 100 saf alıcı WT farelerin felç indüklenen; Bu opticospinal infiltratlar T hücreleri, B hücreleri ve monosit ile ilişkili idi. Seri opticospinal Koherens tomografi (OCT) dinamik görsel sistem tutulumu gösterdi. Fareler AQP4 hedefli CNS T Hücre-aracılı otoimmünite (ATCA) ile kurtarıldı felç ve görsel sistem yaralanma. Kalıcı klinik hastalığa yol açan miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) p35 55 özel T hücreleri tarafından indüklenen EAE aksine yalnız T hücreleri tarafından indüklenen ATCA aksonal kaybı veya retina ganglion hücrelerinin (RGCs) azalma ile ilişkili değildi. Bizim sonuçları birden çok patojen AQP4 T hücre belirleyicileri vardır açıkça gösterdi. ATCA bu yeni model geliştirme nasıl bu hücreleri CNS iltihap neden ve nasıl onlar AQP4 özgü B hücreleri ve NMO patogenezinde tanıtmak için antikorlar ile işbirliği öğrenme patojen AQP4 özgü T hücrelerinin kontrol mekanizmaları eğitim için yararlıdır .
Mevcut raporunda, teşvik ve T hücre kaynaklı ATCA değerlendirmek için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Biz bağışıklama, T hücre kültürü ve Th17 polarizasyon için patojen AQP4 özgü T hücreleri, polarizasyon ve evlat edinen bu T hücreleri transferini onaylamak için Akış Sitometresi Analizi oluşturmak için kullanılan teknikleri ile başlar. Sonra klinik ve histolojik hastalığı ve kullanım, görsel sistem yaralanma alıcı farelerde izlemek için seri Ekim değerlendirmek için kullanılan yöntemleri açıklar.
AQP4 NMO IgG birincil hedef 20053olarak tespit edilmiştir. Sonra bir AQP4 hedefli hayvan modeli CNS otoimmünite kurmak önemli olacağını kabul edildi. Böyle bir model nasıl AQP4 özgü T ve B hücreleri CNS otoimmünite gelişiminde katılmak araştırmaya ve aday therapeutics NMO için test etmek için yararlı olabilir. Her ne kadar klinik veya histolojik hastalık14,17AQP4 özgü T hücre epitopları vahşi tipi farelerde ilk 201013, T hücreleri bu epitopları için yanıt bildirildi tanımlaması neden olmaz. CNS otoimmünite AQP4 için bağışıklık reaktivite dayalı bir model oluşturmak için yetersizlik bir bilmece 2015 zaman kadar kaldı Jones, vd. 25 donör AQP4 p135 153 astarlanmalıdır AQP4– / – fareler T hücrelerden WT farelerde CNS otoimmünite klinik ve histolojik belirtileri neden yeteneğine keşfetmiştir. İlgi, AQP4 p135-153 MHC II (ı-Ab) yüksek afinite17ile bağlamak için tahmin edilmektedir. Tek bir diğer AQP4 amino asit dizisi, 201-220, ı-Ab benzer yüksek afinite ile bağlamak için tahmin edilmektedir. Gerçekten de, biz bu AQP4 p135-153 ve p201-AQP4– / –ama değil WT, fareler sağlam yayılması temin 220 hem gözlenen. Burada, nasıl bir izole ve encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 – ve p201-220-reaktif T hücrelerden AQP4– / – fareler genişletin göstermiştir. WT alıcı fareler Transfer edildiğinde, donör AQP4 reaktif Th17 hücre mononükleer hücre infiltratlar spinal kord ve optik sinir eşlik etti felç indüklenen. Afferent görsel sistem yaralanma iyi AQP4 seropositive NMOSD26olan hastalarda bilinmektedir. Burada, optik sinir iltihabı AQP4 reaktif ve MOG reaktif Th17 hücreleri tarafından indüklenen ayrı görülmektedir. AQP4 özgü Th17 hücreleri optik perineuritis indüklenen ise MOG özgü Th17 hücreler şiddetli optik nörite indüklenen. Ayrıca tarafından seri Ekim AQP4 özgü ve MOG özgü T hücreleri tarafından indüklenen optik sinir iltihabı izlemek için kullanılan teknikleri anlatmıştık. Diğer araştırmacılar şimdi ATCA patojenik mekanizmaları üzerinde odaklanmış kendi çalışmaları ilerletmek için burada açıklanan protokoller uygulamak gerekir.
Bir kolayca bizim protokolündeki üç olası tehlikelere önleyebilirsiniz. İlk, evlat edinen ATCA transferini AQP4– / – donör fareler AQP4 özgü T hücrelerden kullanımını gerektirir. Özellikle, donör WT AQP4 p135 153 özel T hücreleri ATCA alıcı WT fareler neden olmadı. İkinci olarak, bir “su-test” peptit/CFA emülsiyon bağışıklama farelerin AQP4– / – (iletişim kuralı adım 1.5) önce bir damla ile gerçekleştirmek önemlidir. SC enjeksiyon için uygun olduğunda emülsiyon suda dağıtmak değil. Emülsiyon çekilmesini, bir emülsiyon bir kez daha karıştırın, daha soğuk ve su-sınama işlemini yineleyin. Son olarak, aktif donör CNS antijen spesifik T hücreleri CNS otoimmünite T hücreleri dinlenme daha verimli bir şekilde ikna etmek. Bir görsel olarak donör T hücreleri evlat edinen transfer için hasat öncesinde ışık mikroskop altında bu kültürleri incelemeniz gerekir. Hızla hücre bölünmesi kolayca tespit kümeleri oluşturabilir. Kültürleri çok aktive T hücre içerdiğinde, Ayrıca, medya pembe turuncu ya da sarı, pH azalma nedeniyle bile için geçiş. Bir de yayılması için donör AQP4 astarlanmalıdır lenf nodu T hücre aktivasyonu tarafından 3H-timidin birleşme, protokolü adım 3’te açıklandığı gibi değerlendirebilirsiniz.
İki patojen AQP4 T hücre epitopları (1) MHC II ile yüksek ilgi bağlamak ve (2) AQP4– / –ama değil WT güçlü proliferatif yanıtları temin için tahmin bizim keşfimiz fareler bu belirleyicileri hedefleme T hücreleri normal olduğunu göstermektedir timik negatif seçim17tarafından kontrol. AQP4 p135-153 ve p201-220 AQP4– / – farelerde tanınması için kullanılan TCR kapsayacağını benzersiz (Şekil 2), çoğu da klonal silme timik medüller epitel hücreleri tarafından aracılı ile tutarlı olduğu. Diğer tolerogenic mekanizmaları normalde bağışıklık yanıtı için AQP4 engel. Bizim ilk rapor17sonra başka bir grup de AQP4 p201-220 bir encephalitogenic T hücre determinant27içerdiğini gösterdi. Ne zaman α/β (TCRα– / –) T hücre eksikliği fareler yeniden AQP4– / – ile CD4+ T hücreleri, bir encephalitogenic AQP4 özgü T hücre yanıtı, ama bunda ima değil bir AQP4 özgü humoral yanıt, temin mümkün WT fareler AQP4 özgü B hücre yanıtları, AQP4 özgü T hücre yanıtlarını benzer negatif seçim tabi değildir. Nitekim, WT farelerde AQP4 özgü T hücreleri tarafından tek başına indüklenen ATCA ile gözlenen değil, spinal kord akson ve kaybı RGCs, patojen AQP4 özel antikorlar katılımı gerektirebilir. Bu AQP4 hedefli CNS otoimmünite fare modelleri biz normalde AQP4 özgü T hücre ve B hücre bağışıklık kontrol tolerogenic mekanizmaları ile ilgili daha fazla bilgi edinmek gibi gelişmeye devam edecektir açıktır.
Diğer modelleri AQP4 hedefli CNS otoimmünite, aynı zamanda gelişmiş6,16,olmak28,29,30. Her biri NMO patogenezinde için ilgili belirli yönleri çalışmak için avantajlar sunuyor. AQP4 özgü T hücreleri WT fareler6,16,29tespit edilmiştir. Bu AQP4 özgü T hücreleri CNS otoimmünite histolojik değişiklikler neden ama benzer şekilde gözlemler farelerde, WT sıçan AQP4 özgü T hücreleri önemli klinik hastalığın belirtileri neden olmaz. Bu nedenle, T hücre ve B hücre AQP4 özgü bağışıklık yanıtı WT farelerde kısıtlama dayanıklılık mekanizmaları da fareler çalışır durumda. Ne olursa olsun, bir fare modelleri mekanizmaları hastalık patogenezinde ilgili eğitim için kullanma içinde gücü hafife alınmamalı. Knock out, transgenik ve muhabir fareler zenginliği avantajlı olabilir. Ayrıca otoimmünite birkaç temel buluşları fare EAE modeller kullanılarak yapılmış kabul edilmelidir. Örneğin, bu T Hücre klonlar bir öz-antijen için özel gösteri Otoimmün hastalık31,32, otoimmüniteye33 T hücre costimulation rolü ve keşfi aracılık Th17 farklılaşma34 için gelişimsel yolu ilk açıklanan fare EAE modelleri kullanma. Geliştirdiğimiz ATCA fare modeli kullanarak, bir anda geliştirme ve düzenleme, patojen AQP4 özgü bağışıklık yanıtı içinde vivo çalışmada bulunmasını NMO patogenezi ile ilgili önemli bilgiler sağlamak vardır.
The authors have nothing to disclose.
Destek S.S.Z. için Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (RO1 AI073737 ve RO1 NS092835-01), ulusal multipl skleroz Derneği (RG 4768, RG 5179 ve RG 5180), Maisin Vakfı ve Guthy Jackson yardım Vakfı sağlandı.
M. tuberculosis H37Ra | BD Difco | 231141 | Dessicated, killed M. tuberculosis |
Incomplete Freund's Adjuvant | BD Difco | 263910 | |
AQP4 peptide p135-153 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN |
AQP4 peptide p201-220 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP |
MOG peptide p35-55 | Genemed / Auspep | Custom Synthesis | Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
3-way Stopcock | Kimble | 420163-4503 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071 | |
Recombinant Mouse IL-23 | R&D Systems (BioTechne) | 1887-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D Systems (BioTechne) | 406-ML | |
Recombinant Mouse IL-12 | R&D Systems (BioTechne) | 419-ML | |
Thymidine [Methyl-3H] | PerkinElmer | NET027 | |
Glass Fiber Filtermats | PerkinElmer | 1450-421 | |
Anti-mouse antibodies | eBioscience (Affymetrix) | [various] | |
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel | BD Biosciences | 557004 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain | ThermoFisher Scientific | [various] | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Iomomycin (calcium salt) | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Pertussis Toxin from B. pertussis | List Biological Laboratories | 181 | |
10% Formalin | VWR | 89370-094 | |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | |
Foam Biopsy Pads, Rectangular | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Isothesia (isoflurane, USP) | Henry Schein Animal Health | 050033 | NDC : 11695-0500-2 |
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Akorn | NDC: 17478-102-12 | |
Spectralis Diagnostic Imaging Platform | Heidelberg Engineering |