Denne teknik beskriver en effektiv screeningsproces for at vurdere bakterier-specifikke optiske billeddannelse agenter inden for ex vivo menneskelige lungevæv af fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi til hurtig identifikation af lille molekyle kemiske sonde-kandidater med oversætbare potentiale.
Forbedre hastigheden og nøjagtigheden af bakteriel opdagelse er vigtig for tålmodige stratificeringsniveau og til at sikre en hensigtsmæssig anvendelse af antimikrobielle stoffer. At nå dette mål, udviklingen af diagnostiske teknikker til at genkende bakteriel tilstedeværelse i realtid på punkt af pleje er nødvendig. Optisk tænkelig nemlig direkte identifikation af bakterier i værten er en attraktiv tilgang. Flere forsøg på kemiske sonde design og valideringen er blevet undersøgt, men ingen er endnu blevet korrekt oversat til klinikken. Her beskriver vi en metode for ex vivo validering af bakterier-specifikke sonder til identifikation af bakterier i den distale lunge, afbildet af fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi (FCFM). Vores model anvendes ex vivo menneskelige lungevæv og en klinisk godkendt Konfokal laser endomicroscopy (CLE) platform til skærmen roman bakterier-specifikke imaging forbindelser, nøje efterligne imaging betingelser forventes at blive mødt med patienter. Derfor giver screening forbindelser af denne teknik tillid af potentiel klinisk sporbarhed.
Denne teknik beskriver en hurtig screeningsproces for at vurdere bakterier-specifikke optiske billeddannelse agenter inden for ex vivo menneskelige lungevæv af CLE ved hjælp af FCFM til hurtig identificering af forbindelser med potentielle kliniske anvendelighed til at visualisere bakterier i distale lunge in situ.
Der er et presserende globale krav til at rationere antimikrobiel ordination i en tid med stigende antimikrobiel resistens1. Med henblik herpå søgt udviklingen af diagnostiske metoder som act at identificere bakteriel infektion med høj specificitet, sensitivitet, og i realtid er meget2. Aktuelle teknikker til at bekræfte en diagnose af lungebetændelse i kritisk syg patienter, såsom dem i intensivafdelinger (intensivafsnit), afhængige ofte fortolke ikke-specifikke kliniske eller radiologiske funktioner sammen med bakteriekulturen teknikker fra indsugning væsker/væv, hvilket kan tage op til 3 dage til at producere resultater. Derudover bakteriekulturen fra væske indpodet i den distale lunge og hentet er udsat for forurening fra mere proksimale airways3 og er ofte kultur negativ på grund af ledsagende antimikrobiel behandling eller dårlig stikprøver. Derudover er molekylære teknikker såsom polymerase kæde reaktion alt for følsomme, når de anvendes på indsugning væsker, risikere overbehandling af patienter. Nye diagnostiske tilgang er Molekylær optiske billeddannelse, gør i situ Molekylær Patologi af væv en mulighed; udvikling og validering af optiske billeddannelse forbindelser er dog påkrævet. Ikke desto mindre direkte visualisering af bakterier via activatable optisk sonder er potentielt en meget kraftfuld metode til at tillade undersøgelse af tilstedeværelsen og udviklingen af lungebetændelse i patienten, og vigtigere, kunne bruges til at studere vært-patogen interaktioner i svar på terapier i real-time in situ.
CLE er en etableret opsøgende procedure i flere sygdomme4, herunder inden for gastroenterologi5, onkologi6,7, og forhører airways og alveolær sække8, 9. det gør det punkt af pleje strukturel billeddannelse af sygt væv ved hjælp af en fiber imaging bundle, der passerer gennem den arbejdende kanal af en klinisk endoskop og formularer direkte kontakt med væv overfladen til afbildning af Konfokal mikroskopi. Én begrænsning, der er tilbage er imidlertid behovet for generiske kontrastmidler. Derfor kunne brugen af sygdom specifikke sonder, såsom specifikke bakterielle stoffer, langt udvide nytten af denne modalitet ved direkte visualisere bakterier på mistanke om infektionsstedet. Optisk konsulenten tilbyde mange fordele i forhold til andre teknikker ved at aktivere real-time, høj opløsning imaging med diagnostiske potentiale. Derudover tilbyde optisk sonder udsigten til multiplexing til spørgekriterierne flere mål, alle nået til en relativt lav pris. En række af optiske agenter er under udvikling til et sådant formål, men ingen endnu er gennemført med succes inden for klinik10. Vi har syntetiseret et bibliotek med lille molekyle kemiske sonder med specificitet mod bakterier og udviklet en hurtig, effektiv pipeline til evaluering af sonde funktion til at påvise bakteriel lungebetændelse i situ11.
For at identificere egnede sonde kandidater, havde følgende forudsætninger skal opfyldes før forhør af sonde på ex vivo menneskelige lungevæv af FCFM: i) vandig opløselighed, ii) specificitet og selektivitet for hurtigt mærkning klinisk relevante bakterier, iii) et højt signal / støj-forhold, og iv) resistens over for nedbrydning i lunge-miljøet. Sidstnævnte blev vurderet af bronchoalveolar lavage væske (BALF) fra patienter med akut respiratorisk distress syndrom (ARDS), som er en tilstand, der er karakteriseret af proteolytiske og inflammatoriske miljøer i lunge på Intensivafdelinger. Desuden, sonderne skulle have en egnet fluorophore til registrering af et klinisk godkendt optisk CLE imaging enhed inden for menneskelige alveolær lungevæv.
Pipeline afhøre hver af disse forudsætninger var som følger (på hvert stadium, kun sonder, der passerede blev båret frem til næste): (1) et bibliotek af sonder undersøges blev syntetiseret; (2) hver sonde blev føjet til et panel af levende bakterier til Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) for at sikre bakteriel mærkning; (3) selektivitet bakteriel mærkning over pattedyrsceller i co kulturer med primære human neutrofiler blev etableret af CLSM; (4) stabilitet og vellykket mærkning af bakterier i nærværelse af ARDS patienten BALF blev bestemt ved CLSM og Matrix Assisted Laser Desorption/ionisering-tid for flyvning (MALDI-TOF) massespektrometri; (5) optimal koncentration af kandidater blev bestemt ved CLSM, at sikre selektiviteten for bakterier over pattedyrceller blev opretholdt; (6) kandidater blev afbildet af FCFM i suspension og ex vivo menneskelige alveolær lungevæv at sikre stabilitet og som signal til støj var tilstrækkelig til påvisning. Trin 6 er beskrevet indgående i denne protokol. Metode til trin 1-5 har været tidligere rapporteret11.
Nedre luftvejsinfektioner tegner sig for andet højeste sygdomsbyrden globalt12,13, og en betydelig stigning i antallet af infektioner tilskrives antimikrobielt resistente bakterier har været rapporteret14. Lungebetændelse er en almindelig årsag til hospitalsindlæggelse. På Intensivafdelinger, udviklingen af en lungebetændelse forværres af diagnostisk usikkerhed og er forbundet med en ekstremt høj dødelighed sats15. Under udbrud af lungebetændelse, bakterier formere sig under det alveolære rum af den distale lunge, et område, der er relativt sterile, med minimal mikrobiota i sundhed.
I denne metode beskrives forholdsvis sent stadium ex vivo validering af bakterier-specifikke optiske billeddannelse sonder11, men design, syntese, og sonden evaluering forud for begyndelsen denne valideringstrinet er bydende nødvendigt, som tidligere vist11 .
CLE er en spirende kliniske teknik til spørgekriterierne sygdom i situ i realtid. Det giver mange fordele frem for traditionelle teknikker for at undersøge mistanke om pulmonal patologi, der kan indebære en biopsi og samling af lavage væske. Biopsier er invasive og kan forårsage sygelighed og dødelighed i ventilerede patienter, og indsamlede lavage væske er ofte forurenet med bakterier fra de øvre luftveje. Brugen af CLE i påvisning af lungebetændelse er imidlertid noget begrænset på grund af den dårlige tilgængelighed kompatibel Imaging sonder, som kan oplyse sygdom, trods mange samordnet indsats10funktionelle. Kombinere CLE med optisk agenter giver udsigt til diagnosticering lungebetændelse hurtigere og mindre i forhold invasivt til nuværende standard praksis.
De kritiske trin i denne protokol er i forberedelse af prøver og opsætning af CLE-platformen. Opnåelse af menneskeligt væv er relevante for den endelige kliniske anvendelse er også vigtige, såsom menneskelige lungevæv som påvist i denne undersøgelse. Det er nødvendigt at bruge menneskelige væv, fordi omfanget af væv autofluorescence viser stor inter arter variation, og derfor kan vildlede følsomheden af bakterier-sonden er afbildet. Derudover er at opnå etik for hentning og brug af menneskelige lungevæv afgørende. Fra et teknisk niveau, korrekt rengøring er fastgørelse af imaging fiber til billedbehandling LSU platform og kalibrering afgørende for god opløsning og konsekvent billeddannelse, som er at sikre tilsvarende antal bakterier er føjet til hver lunge vævsprøve. For at udvide yderligere nytte af denne metode til screening paneler af sonder, er det nødvendigt at gentage proceduren med en vifte af patogener, som de sandsynligvis være agenser af lungebetændelse.
Den største begrænsning af denne teknik er at klinisk godkendt CLE enheden har kun én laser (488 nm). I øjeblikket, er udvælgelse af fluorophore for sonden design derfor begrænset til brug med dette system, selvom klinisk godkendt enkelt farve enheder findes med excitation bølgelængder af 660 nm og nær-infrarødt. Det er ønskeligt at have en anden laser linje gennemført inden for den samme enhed til at aktivere en sonde skal udvikles med en spektralt særskilte fluorophore at forbedre bakterier-sonde følsomhed over niveauet af væv autofluorescence. Mens tofarvet CLE enheder er under udvikling, de er enten ikke klinisk godkendt og/eller deres omkostninger er betydelig16.
CLE in vitro- ved hjælp af sygdomsfremkaldende bakterier og ex vivo menneskelige lungevæv til skærmen potentielle sonder bygger bro mellem traditionelle in vitro- teknikker som flowcytometri og CLSM og kliniske anvendelighed. Dette trin giver tillid når du vælger lovende forbindelser til at bære frem for at blive koblet med kliniske CLE imaging; og vil give fingerpeg om, hvorvidt testet sonden fastholder målet specificitet, eller viser nogen off-target mærkning, såsom binding direkte til væv, eller viser ustabilitet med værten Proteolytiske enzymer. Det ville også være relevant at tilføje hver af de activatable sonder direkte til prøver af menneskelige lungevæv plus bakterier, til fuldt ud at beskrive hastigheden af sonden bindende og aktivering i realtid.
Vi mener, at vores pipeline for hurtigt screening roman bakterier-specifikke sonder til at vurdere deres potentiale for billeddannelse i den distale lunge patienter vil resultere i meget hurtigere oversættelse til klinikken. Dette skyldes i vid udstrækning, at bakterier-specifikke sonden kunne leveres lokalt i lungerne gennem et kateter indsættes ned arbejde kanal af en bronchoscope, hvilket betyder, at microdose (< 100 µg) beløb kunne leveres. Systemisk levering og biodistributionen af stoffet er derfor ikke en bekymring, som er tilfældet for mange andre infektion mål inden for kroppen, eller med nukleare billeddannelse. Derudover leverer imaging sonden i sådan en lille dosis reducerer risikoen for toksicitet relaterede komplikationer (selv om toksicitet screening ville være påkrævet for oversættelse). Efter instillation af sonden, kunne kateteret derefter erstattes af FCFM fiber og den samme region af lungen forhørt af CLE, meget på samme måde, vi har udført inden for denne metode. Imaging bør foretages hurtigt efter installation af sonden før sonden vasker væk til målbart koncentrationer.
Det er også vigtigt at bemærke, at screening af identifikation af sygdommen sonder ved denne teknik bør ikke begrænses til bakteriel-imaging agenter, men kunne også udvides til validering af sonder med alternative mål, såsom betændelse. Denne fremgangsmåde bør også tilpasses andre sygdom steder i kroppen hvor imaging via FCFM er tilladt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Engineering og Physical Sciences Research Council (EPSRC, Det Forenede Kongerige) tværfaglige forskningssamarbejde grant EP/K03197X/1, Department of Health og Wellcome Trust gennem sundhed Innovation udfordring fond (HICF) . Finansiering referencenummer: 0510-069.
1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |