Dette manuskript beskriver brugen af nasal og bronchiale absorption teknikker, specielt ved hjælp af syntetiske lydabsorberende matricer (SAM) for smagsløgene slimhindebelægning væske (MLF) af de øvre og nedre luftveje. Disse metoder giver bedre standardisering og tolerabilitet end eksisterende respiratorisk stikprøver.
Metoder til nasal absorption (NA) og bronchiale absorption (BA) bruge syntetiske lydabsorberende matricer (SAM) til at absorbere slimhindebelægning væske (MLF) i den menneskelige luftveje. NA er et non-invasiv teknik, som absorberer væske fra ringere turbinate, og forårsager minimalt ubehag. NA har givet reproducerbare resultater med evnen til at ofte gentage prøvetagning af de øvre luftveje.
Til sammenligning, alternative metoder til prøveudtagning respiratoriske slimhinden, såsom nasopharyngeal aspiration (NPA) og konventionelle svaberprøven, er mere invasive og kan resultere i større data variabilitet. Andre metoder har begrænsninger, for eksempel, biopsier og bronchiale procedurer er invasiv, sputum indeholder mange døde og døende celler og kræver fortætning, udåndede ånde kondensat (EBC) indeholder vand og spyt og lavage prøver er fortyndet og variabel.
BA kan udføres gennem arbejde kanal af en bronchoscope i klinikken. Prøveudtagning er veltolereret og kan udføres på flere steder i luftvejene. BA resulterer i MLF prøver at være mindre fortyndet end bronchoalveolar lavage (BAL) prøver.
Denne artikel viser teknikker til NA og BA samt laboratorium behandling af de deraf følgende prøver, som kan skræddersys til den ønskede downstream biomarkør måles. Disse absorption teknikker er nyttige alternativer til konventionel prøveudtagning teknikker anvendt i kliniske respiratorisk forskning.
De fleste luftvejssygdomme forårsage en inflammatorisk reaktion, og der er et presserende behov for prøveudtagning fra det respiratoriske slimhinden i allergisk rhinitis, virus-og svampeinfektioner, tuberkulose, astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, pulmonal fibrose og lunge kræft 1. Nasopharyngeal aspirat (NPA), nasal lavage og bronchoalveolar lavage (BAL) er almindelige teknikker til prøveudtagning af øvre og nedre luftveje. Disse teknikker fremsætte betydelige problemer, herunder dårlig tolerabilitet, fortynding af inflammatoriske mediatorer og manglende evne til at ofte gentage prøveudtagning2. Et alternativ til NPA prøveudtagning er anvendelse af podninger, enten nylon flokkedes, bomuld, eller rayon3,4, men disse har også begrænsninger, da de forårsager ubehag og skade den nasale epitel, og i nogle tilfælde irreversibel binding af inflammatoriske mediatorer5. Disse teknikker kan ikke generelt gentages seriefremstillede over en time, og alternative teknikker kan være mere effektiv til påvisning af lav overflod cytokiner og kemokiner5,6. Derudover kan bruger variabiliteten forbundet med disse teknikker generere uoverensstemmelser i data, hvilket resulterer i krav om større patient kohorter.
Alternativt, absorption teknikker ved hjælp af både naturlige og syntetiske svampe har været brugt til at indsamle MLF fra slimhindeinfektioner. Oftalmologiske svampe består af naturlige cellulose (fxWeck-cel) har været brugt til at prøve spyt, livmoderhalskræft, og vaginalsekret7. Derudover syntetiske svampe fremstillet af polyvinylalkohol (PVA) og hydroxyleret polyvinylacetat (HPVA) har været udnyttet8. Syv forskellige lydabsorberende materialer er blevet sammenlignet for prøvetagning mundtlige væske før måle antistoffer9, mens polyurethan mini-svampe har været brugt til at indsamle menneskelige tårer10.
Filtrerpapir bestående af naturlige cellulose fra bomuld plante har været meget anvendt til at absorbere nasal sekreter siden den banebrydende papir Alam og kolleger i 199211,12,13,14, 15,16,17. Filtrerpapir diske er fremstillet af filter kort (f.eks. Shandon), og har været udnyttet til at måle histaminer og cytokiner efter kontrolleret nasal allergen udfordringer og med naturlige allergen eksponering18,19 ,20,21. Men forskellige batches filtrerpapir varierer i deres grad af protein binding og nogle undlader at frigive cytokiner. Metoder, der bruger en syntetisk lydabsorberende matrix (SAM) er derfor blevet udviklet2,22,23. SAMs er nu generelt bruges til at opnå nasal MLF af NA. Disse absorberende materiale er behagelig at bruge og kan opnå MLF selv fra betændte næser med hyppige mellemrum over længere perioder.
Nasal absorption er en form for præcision slimhinde prøvetagning ved hjælp af en SAM for prøveudtagning af MLF i de øvre luftveje. NA enheder er fremstillet som CE-mærkede medicinske anordninger fra medicinsk grade materialer ved hjælp af rene værelser og er fri for støv og allergener. NA sampler består af et håndtag og SAM i en steril cryotube. SAM består af polymerer, typisk fibre, men det er også tilgængelig som skum, og disse er udvalgt til at være blød og absorberende, med hurtige fugtspredende for prøvetagning. SAMs har minimal protein binding til tillade den effektive eluering af absorberet sekreter. NA er en meget blid, ikke-invasiv teknik, der kan udføres på donorer i alle aldre. Derudover er seriel prøveudtagning, endda hvert par minutter, muligt. NA er blevet valideret mod eksisterende øvre luftveje prøveudtagning teknikker5 og gentagen prøvetagning har tilladt generation af kinetiske data efter udfordring af luftvejene med allergen23,24,25, bakteriel endotoxin26 og viral-type TLR agonister (RIA, A. et al., håndskriftet under forberedelse). NA er også blevet brugt i spædbørn til at undersøge den naturlige historie af atopi27,28,29 og viral bronchiolitis30.
Bronchoscopic microsampling (BMS) er en procedure for samling af MLF i de nedre luftveje, som er blevet udviklet af Olympus31,32,33. Desværre, denne BMS system er kun licenseret i Japan. Olympus leverer to BMS systemer: en med en fiber hydroxyleret polyester (FHPE) sonde34,35,36,37, og en med en bomuld sonde33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. en større anstødssten har været at BMS sonden anvendes hos patienter med astma forårsaget slimhinde kontakt blødning, med halvdelen af alle prøver, der er forurenet med blod. Forfatterne konkluderede, at det ikke var muligt at prøve MLF ved hjælp af denne BMS system fra perifere airways i astma patienter43.
Som et alternativ, har vi udviklet BA ved hjælp af en blød SAM, der kan udføres i bronchoscopic undersøgelse af de nedre luftveje, herunder følge af eksperimentel infektion af astmatiske emner med rhinovirus6. BA enhed består af: en ekstern hule kateter, en hånd-stykke, der ved aktivering Ekstruderer SAM og en central plast guidewire, der har SAM på sin afslutning. Hvad angår NA, BA kits er fremstillet af medicinsk kvalitet materialer ved hjælp af rene værelser og er fri for støv og allergener. Derudover er enheder CE mærket og leveres gamma-bestrålet. SAM strip er blød, absorberende, og har hurtig fugtspredende for prøvetagning. Det har også minimal protein binding til tillade den effektive eluering af absorberet sekreter. Enheden kan passe gennem arbejde kanal af en bronchoscope og kan bruges til hurtigt og prøve præcist MLF på specifikke steder af interesse i luftvejene. I modsætning til BAL eller BMS resulterer BA ikke i kontakt blødning eller yderligere patienternes ubehag efter indgrebet.
Bør overvejes nøje behandling af NA og BA prøver. Prøver kan være direkte frosset og behandles i batches, eller kan være behandlet straks. Typen af behandling kan skræddersys mod visse downstream applikationer, herunder immunassays til cytokiner, kemokiner og immunglobuliner eller elutions af viral, bakteriel, og værten celle associerede RNA. Vi præsenterer kliniske indsamling og laboratorium databehandling knyttet NA og BA som en vejledning for kliniske forskere.
Resultater fra eksisterende luftvejene stikprøveteknikker betragtes som meget varierende; alternative stikprøver er behov for at standardisere forskning inden for dette felt5. NA og BA tillader prøveudtagning af MLF i en ikke-invasiv måde, og har et spændende potentiale til at måle immunrespons i raske og syge airways. Disse teknikker tilbyder mange potentielle fordele over eksisterende teknikker, herunder større tolerabilitet, hastighed af prøveudtagning, evnen til at ofte gentage prøveudtagning, sænke Inter bruger variabilitet, og faldt fortynding af immun mæglere5 . Varigheden af absorption og forarbejdning teknik, der anvendes bør optimeret for hver undersøgelse og strengt opretholdt mellem prøveudtagning begivenheder. Derudover for BA, bør stedet for prøveudtagning i luftvejene være omhyggeligt replikeret mellem individer.
NA, og især BA, er stadig relativt nye teknikker for klinisk forskning. Men fordelene ved disse teknikker har resulteret i deres brug i talrige undersøgelser, herunder omhyggelig validering mod alternative teknikker5. Disse enheder er nu tilgængelige som CE-mærket enheder klar til udbredt anvendelse i respiratoriske forskning. Mens NA og BA resultere i meget mindre prøve diskenheder end alternative stikprøver, kan højere opnåede koncentrationer resultere i større følsomhed for lavt overflod immun mæglere.
Afhængigt af ønskede downstream applikationer, kan NA og BA prøver direkte frosset til senere forarbejdning, forbedre undersøgelse gennemførlighed i en miljø, klinisk forskning. Protokol for eksempel håndtering kan også tilpasses til særlige downstream anvendelser. De foreslåede behandling teknikker kan bruges til samling af protein eller lipid immun mæglere eller nukleinsyrer, men bør optimeres for hver undersøgelse. Især kan MLF være elueret med forskellige buffere. For det første kan immunassay buffer bruges til at måle slimhinde cytokiner, kemokiner og antistoffer6,45. Buffere med højere vaskemiddel kan også bruges til at garantere celle lysis opstår, giver mulighed for optagelse af intra cellulære cytokiner. Chaotropic RNA udvinding buffere bør anvendes til bestemmelse af viral infektion, viral belastning, vært mRNA og microbiome. Alternativt, organiske opløsningsmidler kan bruges til lipidomics og massespektrometri.
Afslutningsvis er direkte absorption af MLF fra slimhindeinfektioner en spændende teknik med potentielle anvendelse i luftvejssygdomme, mave-tarm, urogenitale og andre slimhinde sygdomme. Disse lovende absorption teknikker kræver imidlertid præcis validering af prøveudtagning og behandling teknik for individuelle assays (biomarkører) i hver sygdom indstilling. Derudover vil disse roman præcision slimhinde stikprøveteknikker forlange efterprøvelse mod konventionelle prøver, som fra blod, åndedræt og spyt. Med disse teknikker, kan MLF bruges til at måle mikrober, cytokiner, kemokiner, prostanoids og antistoffer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af midler fra det kejserlige nationale Institut for sundhed Research (NIHR) Biomedical Research Center (BRC), den NIHR sundhed beskyttelse forskning enhed (HPRU) i luftvejsinfektioner på Imperial College London i partnerskab med Public Health England (PHE) og NIHR Imperial patientsikkerhed Translationel forskning centrum. De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR, Department of Health eller Public Health England.
Nasosorption (adult, 7mm width) | Hunt Developments | NSFL-FXI-11 | Different sizes are available for different patient groups/ages. |
Bronchosorption | Hunt Developments | BSFL-FXI-11 | Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm |
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) | Sigma Aldrich | CLS9301-1000EA | |
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) | Sigma Aldrich | CLS8160-24EA | For sterilisation of samples with infection risk. |
Assay (elution) buffer | Millipore | AB-33k | Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA. |
NP-40 Cell lysis buffer | Life Technologies | FNN0021 | Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels. |
Buffer RLT (RNA extraction) | Qiagen | 79216 | Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples. |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031-100ML-M | For elution of samples to be used in HPLC applications |
2.0ml micro-centrifuge tubes | Costar | 3213 | 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these. |