Summary
Dette manuskript beskriver brugen af nasal og bronchiale absorption teknikker, specielt ved hjælp af syntetiske lydabsorberende matricer (SAM) for smagsløgene slimhindebelægning væske (MLF) af de øvre og nedre luftveje. Disse metoder giver bedre standardisering og tolerabilitet end eksisterende respiratorisk stikprøver.
Abstract
Metoder til nasal absorption (NA) og bronchiale absorption (BA) bruge syntetiske lydabsorberende matricer (SAM) til at absorbere slimhindebelægning væske (MLF) i den menneskelige luftveje. NA er et non-invasiv teknik, som absorberer væske fra ringere turbinate, og forårsager minimalt ubehag. NA har givet reproducerbare resultater med evnen til at ofte gentage prøvetagning af de øvre luftveje.
Til sammenligning, alternative metoder til prøveudtagning respiratoriske slimhinden, såsom nasopharyngeal aspiration (NPA) og konventionelle svaberprøven, er mere invasive og kan resultere i større data variabilitet. Andre metoder har begrænsninger, for eksempel, biopsier og bronchiale procedurer er invasiv, sputum indeholder mange døde og døende celler og kræver fortætning, udåndede ånde kondensat (EBC) indeholder vand og spyt og lavage prøver er fortyndet og variabel.
BA kan udføres gennem arbejde kanal af en bronchoscope i klinikken. Prøveudtagning er veltolereret og kan udføres på flere steder i luftvejene. BA resulterer i MLF prøver at være mindre fortyndet end bronchoalveolar lavage (BAL) prøver.
Denne artikel viser teknikker til NA og BA samt laboratorium behandling af de deraf følgende prøver, som kan skræddersys til den ønskede downstream biomarkør måles. Disse absorption teknikker er nyttige alternativer til konventionel prøveudtagning teknikker anvendt i kliniske respiratorisk forskning.
Introduction
De fleste luftvejssygdomme forårsage en inflammatorisk reaktion, og der er et presserende behov for prøveudtagning fra det respiratoriske slimhinden i allergisk rhinitis, virus-og svampeinfektioner, tuberkulose, astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, pulmonal fibrose og lunge kræft 1. Nasopharyngeal aspirat (NPA), nasal lavage og bronchoalveolar lavage (BAL) er almindelige teknikker til prøveudtagning af øvre og nedre luftveje. Disse teknikker fremsætte betydelige problemer, herunder dårlig tolerabilitet, fortynding af inflammatoriske mediatorer og manglende evne til at ofte gentage prøveudtagning2. Et alternativ til NPA prøveudtagning er anvendelse af podninger, enten nylon flokkedes, bomuld, eller rayon3,4, men disse har også begrænsninger, da de forårsager ubehag og skade den nasale epitel, og i nogle tilfælde irreversibel binding af inflammatoriske mediatorer5. Disse teknikker kan ikke generelt gentages seriefremstillede over en time, og alternative teknikker kan være mere effektiv til påvisning af lav overflod cytokiner og kemokiner5,6. Derudover kan bruger variabiliteten forbundet med disse teknikker generere uoverensstemmelser i data, hvilket resulterer i krav om større patient kohorter.
Alternativt, absorption teknikker ved hjælp af både naturlige og syntetiske svampe har været brugt til at indsamle MLF fra slimhindeinfektioner. Oftalmologiske svampe består af naturlige cellulose (fxWeck-cel) har været brugt til at prøve spyt, livmoderhalskræft, og vaginalsekret7. Derudover syntetiske svampe fremstillet af polyvinylalkohol (PVA) og hydroxyleret polyvinylacetat (HPVA) har været udnyttet8. Syv forskellige lydabsorberende materialer er blevet sammenlignet for prøvetagning mundtlige væske før måle antistoffer9, mens polyurethan mini-svampe har været brugt til at indsamle menneskelige tårer10.
Filtrerpapir bestående af naturlige cellulose fra bomuld plante har været meget anvendt til at absorbere nasal sekreter siden den banebrydende papir Alam og kolleger i 199211,12,13,14, 15,16,17. Filtrerpapir diske er fremstillet af filter kort (f.eks. Shandon), og har været udnyttet til at måle histaminer og cytokiner efter kontrolleret nasal allergen udfordringer og med naturlige allergen eksponering18,19 ,20,21. Men forskellige batches filtrerpapir varierer i deres grad af protein binding og nogle undlader at frigive cytokiner. Metoder, der bruger en syntetisk lydabsorberende matrix (SAM) er derfor blevet udviklet2,22,23. SAMs er nu generelt bruges til at opnå nasal MLF af NA. Disse absorberende materiale er behagelig at bruge og kan opnå MLF selv fra betændte næser med hyppige mellemrum over længere perioder.
Nasal absorption er en form for præcision slimhinde prøvetagning ved hjælp af en SAM for prøveudtagning af MLF i de øvre luftveje. NA enheder er fremstillet som CE-mærkede medicinske anordninger fra medicinsk grade materialer ved hjælp af rene værelser og er fri for støv og allergener. NA sampler består af et håndtag og SAM i en steril cryotube. SAM består af polymerer, typisk fibre, men det er også tilgængelig som skum, og disse er udvalgt til at være blød og absorberende, med hurtige fugtspredende for prøvetagning. SAMs har minimal protein binding til tillade den effektive eluering af absorberet sekreter. NA er en meget blid, ikke-invasiv teknik, der kan udføres på donorer i alle aldre. Derudover er seriel prøveudtagning, endda hvert par minutter, muligt. NA er blevet valideret mod eksisterende øvre luftveje prøveudtagning teknikker5 og gentagen prøvetagning har tilladt generation af kinetiske data efter udfordring af luftvejene med allergen23,24,25, bakteriel endotoxin26 og viral-type TLR agonister (RIA, A. et al., håndskriftet under forberedelse). NA er også blevet brugt i spædbørn til at undersøge den naturlige historie af atopi27,28,29 og viral bronchiolitis30.
Bronchoscopic microsampling (BMS) er en procedure for samling af MLF i de nedre luftveje, som er blevet udviklet af Olympus31,32,33. Desværre, denne BMS system er kun licenseret i Japan. Olympus leverer to BMS systemer: en med en fiber hydroxyleret polyester (FHPE) sonde34,35,36,37, og en med en bomuld sonde33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. en større anstødssten har været at BMS sonden anvendes hos patienter med astma forårsaget slimhinde kontakt blødning, med halvdelen af alle prøver, der er forurenet med blod. Forfatterne konkluderede, at det ikke var muligt at prøve MLF ved hjælp af denne BMS system fra perifere airways i astma patienter43.
Som et alternativ, har vi udviklet BA ved hjælp af en blød SAM, der kan udføres i bronchoscopic undersøgelse af de nedre luftveje, herunder følge af eksperimentel infektion af astmatiske emner med rhinovirus6. BA enhed består af: en ekstern hule kateter, en hånd-stykke, der ved aktivering Ekstruderer SAM og en central plast guidewire, der har SAM på sin afslutning. Hvad angår NA, BA kits er fremstillet af medicinsk kvalitet materialer ved hjælp af rene værelser og er fri for støv og allergener. Derudover er enheder CE mærket og leveres gamma-bestrålet. SAM strip er blød, absorberende, og har hurtig fugtspredende for prøvetagning. Det har også minimal protein binding til tillade den effektive eluering af absorberet sekreter. Enheden kan passe gennem arbejde kanal af en bronchoscope og kan bruges til hurtigt og prøve præcist MLF på specifikke steder af interesse i luftvejene. I modsætning til BAL eller BMS resulterer BA ikke i kontakt blødning eller yderligere patienternes ubehag efter indgrebet.
Bør overvejes nøje behandling af NA og BA prøver. Prøver kan være direkte frosset og behandles i batches, eller kan være behandlet straks. Typen af behandling kan skræddersys mod visse downstream applikationer, herunder immunassays til cytokiner, kemokiner og immunglobuliner eller elutions af viral, bakteriel, og værten celle associerede RNA. Vi præsenterer kliniske indsamling og laboratorium databehandling knyttet NA og BA som en vejledning for kliniske forskere.
Protocol
De teknikker, der anvendes i følgende protokol er blevet godkendt af West London forskning etiske komité (referencenummer 15/lO/0444).
1. nasal Absorption (NA)
-
Forberedelse før NA prøveudtagning
- Når de udfører NA, først vaske hænder og sætte på handsker, helst foran patienten.
- Inspicere næsehulen ved hjælp af et hoved fakkel, og har klinikeren, bruge deres ikke-dominerende tommelfinger til at trække patientens næse for at visualisere næsehulen.
Bemærk: Normalt kræves der ikke en nasal speculum. - Visualisere næsehulen og ringere turbinate før prøvetagning.
Bemærk: Nares (næsebor) ikke er runde i tværsnit, og de går lige bagud. Generelt ringere turbinate kan ses som en bule eller indrykning på den laterale væg af næsebor, med næseskillevæggen danner den glatte, flade mediale væg. Vi ønsker at prøve fra dette ringere turbinate, da den underliggende epitel er en simpel ciliated epitel af luftveje44.
-
NA prøveudtagning
- Ved udtagning, passere NA SAM forsigtigt op lumen af næsebor, orientere det at være flad mod ringere turbinate.
- Bede donor til at bruge en pegefinger til at trykke SAM på næseslimhinden. NA kan forårsage et lille kildrende, med mulige øje vanding, som MLF absorberes.
Bemærk: Hos voksne, vi generelt udføre NA for 60 s. - Efter absorption af MLF, fjerne enheden NA fra næsebor og sat tilbage i den oprindelige tube.
- Behandle prøver straks i laboratoriet eller fryse dem, som beskrevet senere i denne protokol.
Bemærk: NA er undersøgt i en række forskellige nasal slimhinde udfordring modeller, og også i forskellige airways sygdomme. Validering mod andre respiratoriske prøveudtagningsmetoder bør dog udføres for hver undersøgelse og patienten befolkning.
2. bronchiale Absorption (BA)
-
Forberedelse før BA prøveudtagning
Bemærk: BA udføres af specialiseret personale i en bronkoskopi suite.- Før du placerer enheden BA ned kateteret, kontrollere, at SAM ekstrudering og trække tilbage i kateteret.
- Inden udførelse BA på en patient, foretage en mock BA på en bronkoskopi simulator.
-
BA prøveudtagning
- Passere bronchoscope ned luftrør og højre vigtigste Bronkie til niveauet for den Bronkie intermedius, lige proksimalt for opdelingen i de nederste højre og højre midterste lapper.
Bemærk: Vi typisk prøve fra Bronkie intermedius, selvom andre websteder i luftvejene kan smages. Når observere kateter og SAM, kan man se bronchoscope tip. Vi observerer de følgende enkle trin for BA, når bronchoscope har nået den ønskede prøvetagningsstedet. - KATETER ned: Indsæt BA kateteret gennem driftskanal på bronchoscope indtil den hvide spids er kun synlige i luftvejene, til et maksimum på 1 cm distalt for afslutningen af bronchoscope. Holde bronchoscope og kateter spidsen i midten af lumen af luftvejene. Vær omhyggelig med at minimere kontakt mellem kateter tip og bronchiale slimhinden til at reducere risikoen for slid til slimhinden.
- SAM OUT: Trykkes håndtaget af BA enhed således at SAM er ekstruderet i lumen af højre midterste eller nederste højre lobe luftvejene. Under direkte udsyn, bøje spidsen af bronchoscope at sikre, at SAM gør kontakt med MLF på luftvejene væg. Forlade SAM i luftvejene, flad til en slimhinde væg 30 s.
- SAM IN: Se gennem bronchoscope til at sikre, at fugtig SAM sonden er lige og ikke bøjet tilbage over slutningen af kateteret. Hvis det er påkrævet, kan kateter og bronchoscope spidsen bringes tilbage til rette SAM. Under direkte udsyn, trække den lige SAM forsigtigt tilbage i kateteret.
Bemærk: Hvis der er vanskeligheder tilbagetrækningskraften SAM tilbage ind i kateteret, tilbagekalde hele enheden med SAM ekstruderet tilbage ud af luftvejene. - KATETER op: Opsige driftskanal på bronchoscope hele kateteret.
- SKÅRET af SAM: SAM er afskåret med en steril saks og sættes derefter i en cryotube på is. Disse prøver kan behandles med forskellige metoder, som beskrevet senere i denne protokol.
- Passere bronchoscope ned luftrør og højre vigtigste Bronkie til niveauet for den Bronkie intermedius, lige proksimalt for opdelingen i de nederste højre og højre midterste lapper.
3. behandling af NA og BA prøver
Bemærk: Der er talrige muligheder for laboratoriet behandling af prøver som følge af NA og BA. Disse protokoller søger at gemme prøver til senere brug, og elueres MLF prøven fra SAM.
-
Indstillinger for omgående håndtering af prøver, NA og BA
- Valgmulighed 1: Gemme den fugtige SAM på is et par timer før videre behandling.
- Mulighed 2: Straks dybfryser NA SAMs i collection tube. På samme måde, fryse BA SAMs i kryogene hætteglas efter fjernelse, med saks, fra prøveudtagning enhed.
- Mulighed 3: Placer de fritliggende SAM i eluering buffer (300 µL) før behandling direkte eller dyb frysning.
-
Indstillinger af eluering buffer for NA og BA prøver
Bemærk: Valget af eluering buffer afhænger af, hvad der skal analyseres i eksemplet MLF og vi foreslår fire vigtigste alternativer:- Bruge en forberedte analysebuffer egnet til immunassay procedurer. Sådanne buffere bør indeholde en lille mængde vaskemiddel (0,05%) samt protein, fx bovint serumalbumin (BSA) på 1%.
- Alternativt, brug en buffer, som indeholder en større mængde vaskemiddel, således at celle lysis opstår.
Bemærk: Vi bruger buffere indeholdende Triton-X eller NP40 på 1% koncentration. Celle lysis buffere aktiverer både intracellulære og ekstracellulære cytokiner være elueres fra SAM, og generelt resultere i højere niveauer af cytokiner og kemokiner. Disse buffere bør også indeholde protein, og er lavet med BSA til 1%. - RNA målinger, som kvantitativ PCR af viral RNA eller måle vært RNA, tilføje RNA ekstraktionsbuffer direkte til den fugtige SAM.
Bemærk: Chaotropic RNA udvinding buffere indeholder guanidinium, der denaturerer proteiner. Et alternativ er at tilføre eluted MLF væsken indeholdt i immunassay eller celle lysisbuffer RNA ekstraktionsbuffer. - Bruge organiske opløsningsmidler, såsom trifluoreddikesyre, for udvinding af lipider og metabolitter, nemlig evaluering af massespektrometri.
Bemærk: Detaljer om alle disse reagenser er inkluderet i afsnittet materialer.
-
Eluering teknik
- For nogen af de ovenstående eluering teknikker, skal du indsætte SAM i et 2 mL micro-centrifugerør, sammen med den ønskede ekstraktionsbuffer.
- Vortex Bland prøven for 30 s til at vaske SAM løst vedlagte væsker og biomolekyler.
- For at sikre fuld prøve opsving, udføre centrifugal eluering ved at tilføje den fugtige SAM til en spin mini filterkolonne, indsætter i den samme 2 mL micro-centrifugerør anvendes til vask.
Bemærk: To typer af spin filteret mini kolonne kan bruges. Først indeholder kun en plastik mesh, som holder SAM på plads, giver mulighed for fuld eluering af væsker. Alternativt, hvis arbejder med smitsomme materialer, brug spin filtre med en 0,22 µm porestørrelse. Disse filtre vil sterilisere prøver og er velegnet til prøver med mykobakterielle mistanken. Disse filtre bør dog pre rugede med buffer, minimere binding af mæglere til filteret med uspecifikke interaktioner. - Bruge steriliseret pincet til at overføre den fugtige SAM til spin filteret. Ændre pincet mellem prøver at forhindre forurening.
- Centrifuge prøver i 20 min. på 16.000 x g i en mini centrifuge afkølet til 4 ° C.
-
Sammenfattende eksempel protokol
- I laboratoriet, etiket 2 mL micro-centrifugeglas for prøvetagning og tilføje den ønskede mængde af eluering buffer (typisk 300 µL for NA; 100 µL for BA). Forsegle låg og Anbring på is.
- Efter prøvetagning (enten umiddelbart eller i laboratoriet) SAM er fjernet fra håndtaget med pincet og placeret i bufferen indeholder collection tube (produceret i forrige trin). Sikre hætten af microcentrifuge røret er lukket forsvarligt og overføre prøver på is, til laboratoriet til videre behandling.
- Fjerne rør indeholdende SAM og eluering buffer fra deres overførsel container og vortex mix for 30 s.
- Brug steril pincet, fjerne SAM og placere i en spin kolonne (med eller uden 0,22 µm celluloseacetat filter).
- Indsamle eluering buffer fra collection tube og bevare.
- Placer kolonnen spin med SAM, i den oprindelige samling tube (eller en ny Hvis steril-filtrering prøver) og tilføje samling buffer for at dreje kolonne. På denne måde, vil vask væske passerer gennem kolonnen spin tilbage i collection tube, at hjælpe for at eluere prøve fra SAM.
- Der centrifugeres prøverne med låg forseglet (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).
- Fjernes prøverne fra centrifugen og placere i en rack.
- Åbn lukkede låget på rørene og fjern kolonnen spin indeholdende SAM. Bortskaffe SAM og spin kolonne i en passende spildbakken.
- Omhyggeligt rør alikvot eluatet indeholdt i røret ind i mærket kryogene. Registrere den samlede mængde af eluatet og volumen i hver delprøve.
- Overføre de lukkede kryogenbeholdere rør til en-80 ° C fryser og opbevare opretstående indtil brug.
Representative Results
NA er blevet udnyttet i en række undersøgelser til let og ikke-invasivt måle slimhindeinflammation. Efter administration af allergen til næsen, prostaglandin-D2 (PGD2) niveauer kan observeres til stiger og falder inden for få minutter (figur 1), i overensstemmelse med mast celle degranulering (Thwaites et al., håndskriftet under forberedelse). Desuden kan mediatorer af type-II betændelse, såsom IL-5 (figur 2, genoptrykt med tilladelse fra 24), der måles i timerne efter nasal allergen udfordring23,24. I eksperimentel infektion af allergisk astmatikere og raske kontrolpersoner, blev NA brugt til at måle et panel af mæglere, herunder interferon-gamma (IFN-γ), i løbet af 7 dage (figur 3, genoptrykt med tilladelse fra 6). Derudover demonstreret naturlige respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektion af spædbørn, NA RSV for at være forbundet med forhøjede niveauer af inflammatoriske cytokiner, såsom IFN-γ, i forhold til ikke-RSV spædbørn med bronchiolitis og raske kontrolpersoner ( Figur 4, genoptrykt med tilladelse fra 30). Interessant, var denne forskelsbehandling mellem RSV og ikke-RSV bronchiolitis ikke signifikant i tid-matchede NPA prøver (figur 4).
BA blev også brugt i løbet af eksperimentel infektion af allergisk astmatikere med rhinovirus. På dag 4 af rhinovirus infektion, niveauer af IFN-γ, CXCL11, blev IL-10, og IL-5 forhøjet fra baseline (figur 5; A, B, C og D, henholdsvis). Desuden, påvist denne teknik forhøjede IL-5 niveauer i de nedre luftveje af allergisk astmatikere under rhinovirus infektion, i forhold til raske kontrolpersoner (fig. 5 d) (figur 5 genoptrykt med tilladelse fra 6).
Disse repræsentative resultater blev genereret fra prøver elueret med analysebuffer indeholdende 0,05% Tween-20 og 1% BSA (Se Tabel af materialer).
Figur 1 : Hurtige generation og clearance af prostaglandin-D2 efter nasal allergen udfordring. Niveauer af prostaglandin-D2 (PGD2) måles fra nasal absorption eluater i serie prøver efter nasal allergen udfordring med Timothy græs pollen (n = 5). Hver linje repræsenterer data fra et individ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Kinetic måling af IL-5 efter nasal allergen udfordring. Produktionen af IL-5 i serie nasal absorption prøver efter nasal allergen udfordring. Tre gentage allergen udfordring undersøgelser blev gennemført, med deltagerne (n = 19) modtager placebo (blå), lav dosis (10 mg) mundtlige prednison (orange) eller høj dosis (25 mg) mundtlige prednison (rød) en time inden allergen administration. Linjerne betegner geometriske middelværdi og fejl barer er 95%-konfidensintervallerne for alle deltagere. (Figur genoptrykt med tilladelse fra Leaker et al., Slimhindeimmunologi, 2017). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Induktion af Interferon-γ under rhinovirus infektion. Under infektion udfordring af sunde voksne (n = 11, blå) og allergiske astmatikere (n = 28, red) med rhinovirus-16, nasal absorption prøvetagning blev brugt til at måle niveauet af interferon-γ (IFN-γ). Data repræsenteres som A) rå spaghetti parceller af personer og B) median niveauer med fejllinjer betegner interkvartil intervaller. (Figur genoptrykt med tilladelse fra Hansel et al. 6). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Nasosorption diskriminerer forhøjede Interferon-γ tilknyttet RSV infektion af spædbørn. Nasal absorption og nasopharyngeal aspiration (NPA) blev brugt til at måle interferon-γ niveauer hos spædbørn med bronchiolitis tilknyttet respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektion (rød, n = 12), en ikke-RSV respiratorisk patogen (grøn, n = 12), og sund kontrol (blå, n = 9). Data blev analyseret ved hjælp af en Kruskall-Wallis test med Dunns korrektion for flere sammenligninger (***p< 0,001). Linjerne betegner median værdier og fejl barer er interkvartil intervaller. (Figur ændres med tilladelse fra Thwaites et al. 30). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Inflammatoriske mediatorer i bronchiale absorption prøver under rhinovirus infektion.
Efter rhinovirus-16 infektion af raske kontrolpersoner (n = 10, blå) og allergisk astma frivillige (n = 23, red), bronkial absorption blev brugt til at måle niveauet af A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 og D) IL-5 på baseline og på dag 4 af infektion. Data analyseret ved Wilcoxon underskrevet rank test (matchede prøver) og Mann-Whitney test (uovertruffen prøver). Figur genoptrykt med tilladelse fra Hansel et al. 6 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Resultater fra eksisterende luftvejene stikprøveteknikker betragtes som meget varierende; alternative stikprøver er behov for at standardisere forskning inden for dette felt5. NA og BA tillader prøveudtagning af MLF i en ikke-invasiv måde, og har et spændende potentiale til at måle immunrespons i raske og syge airways. Disse teknikker tilbyder mange potentielle fordele over eksisterende teknikker, herunder større tolerabilitet, hastighed af prøveudtagning, evnen til at ofte gentage prøveudtagning, sænke Inter bruger variabilitet, og faldt fortynding af immun mæglere5 . Varigheden af absorption og forarbejdning teknik, der anvendes bør optimeret for hver undersøgelse og strengt opretholdt mellem prøveudtagning begivenheder. Derudover for BA, bør stedet for prøveudtagning i luftvejene være omhyggeligt replikeret mellem individer.
NA, og især BA, er stadig relativt nye teknikker for klinisk forskning. Men fordelene ved disse teknikker har resulteret i deres brug i talrige undersøgelser, herunder omhyggelig validering mod alternative teknikker5. Disse enheder er nu tilgængelige som CE-mærket enheder klar til udbredt anvendelse i respiratoriske forskning. Mens NA og BA resultere i meget mindre prøve diskenheder end alternative stikprøver, kan højere opnåede koncentrationer resultere i større følsomhed for lavt overflod immun mæglere.
Afhængigt af ønskede downstream applikationer, kan NA og BA prøver direkte frosset til senere forarbejdning, forbedre undersøgelse gennemførlighed i en miljø, klinisk forskning. Protokol for eksempel håndtering kan også tilpasses til særlige downstream anvendelser. De foreslåede behandling teknikker kan bruges til samling af protein eller lipid immun mæglere eller nukleinsyrer, men bør optimeres for hver undersøgelse. Især kan MLF være elueret med forskellige buffere. For det første kan immunassay buffer bruges til at måle slimhinde cytokiner, kemokiner og antistoffer6,45. Buffere med højere vaskemiddel kan også bruges til at garantere celle lysis opstår, giver mulighed for optagelse af intra cellulære cytokiner. Chaotropic RNA udvinding buffere bør anvendes til bestemmelse af viral infektion, viral belastning, vært mRNA og microbiome. Alternativt, organiske opløsningsmidler kan bruges til lipidomics og massespektrometri.
Afslutningsvis er direkte absorption af MLF fra slimhindeinfektioner en spændende teknik med potentielle anvendelse i luftvejssygdomme, mave-tarm, urogenitale og andre slimhinde sygdomme. Disse lovende absorption teknikker kræver imidlertid præcis validering af prøveudtagning og behandling teknik for individuelle assays (biomarkører) i hver sygdom indstilling. Derudover vil disse roman præcision slimhinde stikprøveteknikker forlange efterprøvelse mod konventionelle prøver, som fra blod, åndedræt og spyt. Med disse teknikker, kan MLF bruges til at måle mikrober, cytokiner, kemokiner, prostanoids og antistoffer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af midler fra det kejserlige nationale Institut for sundhed Research (NIHR) Biomedical Research Center (BRC), den NIHR sundhed beskyttelse forskning enhed (HPRU) i luftvejsinfektioner på Imperial College London i partnerskab med Public Health England (PHE) og NIHR Imperial patientsikkerhed Translationel forskning centrum. De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR, Department of Health eller Public Health England.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasosorption (adult, 7mm width) | Hunt Developments | NSFL-FXI-11 | Different sizes are available for different patient groups/ages. |
| Bronchosorption | Hunt Developments | BSFL-FXI-11 | Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) | Sigma Aldrich | CLS9301-1000EA | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) | Sigma Aldrich | CLS8160-24EA | For sterilisation of samples with infection risk. |
| Assay (elution) buffer | Millipore | AB-33k | Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA. |
| NP-40 Cell lysis buffer | Life Technologies | FNN0021 | Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels. |
| Buffer RLT (RNA extraction) | Qiagen | 79216 | Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031-100ML-M | For elution of samples to be used in HPLC applications |
| 2.0ml micro-centrifuge tubes | Costar | 3213 | 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these. |
References
- Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
- Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
- Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
- Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best? Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
- Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
- Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
- Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
- Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
- Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
- Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
- Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
- Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M.
- Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
- Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
- Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
- Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
- Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
- Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
- Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
- Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
- Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
- Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
- Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
- Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
- Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
- Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
- Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
- Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
- Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
- Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).
