यह पांडुलिपि नाक और दमा अवशोषण तकनीक के उपयोग का वर्णन करता है, विशेष रूप से सिंथेटिक अवशोषण मैट्रिक्स (सैम) का उपयोग श्लैष्मिक अस्तर द्रव (MLF) ऊपरी और निचले airway के नमूने के लिए । इन तरीकों को बेहतर मानकीकरण और मौजूदा श्वसन नमूना तकनीक की तुलना में सहनशीलता प्रदान करते हैं ।
नाक अवशोषण (एनए) और दमा अवशोषण (BA) के तरीकों सिंथेटिक अवशोषण मैट्रिक्स (सैम) का उपयोग करने के लिए मानव श्वसन तंत्र के श्लैष्मिक अस्तर द्रव (MLF) को अवशोषित । NA एक गैर इनवेसिव तकनीक है जो अवर turbinate से द्रव को अवशोषित कर लेता है, और न्यूनतम असुविधा का कारण बनता है । NA प्रतिलिपि परिणाम अक्सर ऊपरी airway के नमूने दोहराने की क्षमता के साथ झुकेंगे है ।
तुलना करके, श्वसन म्यूकोसा के नमूने के वैकल्पिक तरीकों जैसे nasopharyngeal आकांक्षा (एनपीए) और पारंपरिक swabbing, अधिक आक्रामक होते है और अधिक से अधिक डेटा परिवर्तनशीलता में परिणाम हो सकता है । अंय तरीकों की सीमाएं हैं, उदाहरण के लिए, बायोप्सी और दमा प्रक्रियाओं आक्रामक हैं, थूक कई मृत और मर कोशिकाओं शामिल है और द्रवीकरण की आवश्यकता है, exhaled सांस घनीभूत (EBC) पानी और लार शामिल हैं, और लेवेज नमूने पतला कर रहे है और चर.
BA क्लिनिक में एक bronchoscope के कार्य चैनल के माध्यम से किया जा सकता है । नमूना अच्छी तरह से सहन और airway में कई साइटों पर आयोजित किया जा सकता है । MLF नमूनों में बीए परिणाम bronchoalveolar लेवेज (बाल) नमूनों की तुलना में कम पतला किया जा रहा है ।
यह लेख ना और बीए की तकनीकों को प्रदर्शित करता है, साथ ही परिणामस्वरूप नमूनों की प्रयोगशाला प्रसंस्करण, जो वांछित बहाव के लिए सिलवाया जा सकता है, मापा जा रहा है । इन अवशोषण तकनीक पारंपरिक नमूना नैदानिक श्वसन अनुसंधान में इस्तेमाल तकनीक के लिए उपयोगी विकल्प हैं ।
सबसे श्वसन रोगों एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण, और वहाँ एलर्जी rhinitis, वायरल और फंगल संक्रमण, तपेदिक, अस्थमा, जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग, फेफड़े में श्वसन श्लैष्मिक सतह से नमूने के लिए एक तत्काल जरूरत है फाइब्रोसिस और फेफड़ों का कैंसर 1. Nasopharyngeal महाप्राण (एनपीए), नाक लेवेज, और bronchoalveolar लेवेज (बाल) ऊपरी और निचले airway के नमूने के लिए आम तकनीक हैं । हालांकि, इन तकनीकों गरीब सहनशीलता, भड़काऊ मध्यस्थों के कमजोर पड़ने सहित काफी समस्याओं मौजूद है, और अक्सर2नमूना दोहराने की अक्षमता । एक विकल्प के लिए एनपीएस नमूना झाड़ू का उपयोग है, या तो नायलॉन आते हैं, कपास, या रेयान3,4, लेकिन ये भी सीमाएं हैं, क्योंकि वे परेशानी और नाक उपकला को नुकसान का कारण, और कुछ मामलों में अपरिवर्तनीय के बंधन भड़काऊ मध्यस्थों5. इन तकनीकों को आम तौर पर एक घंटे से अधिक नहीं दोहराया जा सकता है, और वैकल्पिक तकनीक कम बहुतायत साइटोकिंस और chemokines5,6का पता लगाने के लिए और अधिक प्रभावी हो सकता है । इसके अतिरिक्त, इन तकनीकों से संबंधित उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता डेटा में असंगतताएं जेनरेट कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप बड़ा रोगी पलटने की आवश्यकता होती है ।
वैकल्पिक रूप से, दोनों प्राकृतिक और सिंथेटिक स्पंज का उपयोग कर अवशोषण तकनीक श्लैष्मिक सतहों से MLF इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्राकृतिक फाइबर से बना नेत्र स्पंज (जैसे, Weck-cel) लार, ग्रीवा, और योनि स्राव7नमूना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, polyvinyl अल्कोहल (PVA) और hydroxylated polyvinyl एसीटेट (HPVA) से बने सिंथेटिक स्पंज को8का उपयोग किया गया है । सात अलग अवशोषण सामग्री मौखिक द्रव नमूने के लिए की तुलना में किया गया है एंटीबॉडी9को मापने से पहले, जबकि मिनी स्पंज मानव आँसू10इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
फिल्टर कपास संयंत्र से प्राकृतिक फाइबर से मिलकर कागज व्यापक रूप से आलम और सहयोगियों के १९९२11,12में अग्रणी कागज के बाद से नाक के स्राव को अवशोषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है,13,14, 15,16,17. फ़िल्टर पेपर डिस्क फ़िल्टर कार्ड (उदा Shandon) से उत्पादित किया गया है, और नियंत्रित नाक एलर्जी की चुनौतियों के बाद और प्राकृतिक एलर्जी जोखिम के साथ histamines और साइटोकिंस को मापने के लिए उपयोग किया गया है18,19 ,20,21. हालांकि, फिल्टर कागज के विभिंन बैचों प्रोटीन बाध्यकारी की उनकी डिग्री में भिंनता है और कुछ साइटोकिंस जारी करने में विफल । एक सिंथेटिक अवशोषण मैट्रिक्स (सैम) का उपयोग कर तरीके इसलिए2,22,23विकसित किया गया है । SAMs अब आम तौर पर ना करके नाक MLF प्राप्त करते थे. इन शोषक सामग्री का उपयोग करने के लिए आरामदायक है और समय की विस्तारित अवधि में लगातार अंतराल पर सूजन नाक से भी MLF प्राप्त कर सकते हैं ।
नाक अवशोषण परिशुद्धता श्लैष्मिक नमूना का एक रूप है MLF के ऊपरी airway में नमूना के लिए एक सैम का उपयोग कर । ना उपकरणों के रूप में निर्मित कर रहे हैं CE-साफ कमरे का उपयोग चिकित्सा ग्रेड सामग्री से चिकित्सा उपकरणों के रूप में चिह्नित और धूल और एलर्जी से मुक्त हैं. ना पारखी एक संभाल और एक बाँझ cryotube में सैम के होते हैं. सैम पॉलिमर के होते हैं, आमतौर पर फाइबर, लेकिन यह भी फोम के रूप में उपलब्ध है, और इन नरम और अवशोषण होना करने के लिए चुना जाता है, नमूना संग्रह के लिए तेजी से बाती के साथ. SAMs कम प्रोटीन के लिए अवशोषित स्राव के कुशल रेफरेंस की अनुमति बाध्यकारी है । ना एक बहुत ही कोमल, गैर इनवेसिव तकनीक है कि सभी उंर के दाताओं पर किया जा सकता है । इसके अलावा, सीरियल नमूना, यहां तक कि हर कुछ मिनट, संभव है । ना मौजूदा ऊपरी airway नमूना तकनीक के खिलाफ मांय किया गया है5 और दोहराव नमूना है एलर्जी के साथ airway की चुनौती के बाद काइनेटिक डेटा के उत्पादन की अनुमति दी है23,24,25, बैक्टीरियल endotoxin26 और वायरल-प्रकार TLR एगोनिस्ट (झा, ए. एट अल., तैयारी में पांडुलिपि) । ना शिशुओं में भी27,28,29 और वायरल bronchiolitis30के प्राकृतिक इतिहास की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
Bronchoscopic microsampling (बीएमएस) कम airway है कि ओलिंप31,३२,३३द्वारा विकसित किया गया है में MLF के संग्रह के लिए एक प्रक्रिया है । दुर्भाग्यवश, इस बीएमएस सिस्टम का जापान में ही लाइसेंस है । ओलिंप आपूर्ति दो बीएमएस सिस्टम: एक रेशेदार hydroxylated पॉलिएस्टर (FHPE) जांच के साथ३४,३५,३६,३७, और एक कपास की जांच के साथ एक३३,३८, ३९ , ४० , ४१ , ४२ , ४३. एक प्रमुख कारण ब्लॉक किया गया है कि बीएमएस जांच अस्थमा के साथ रोगियों में इस्तेमाल किया श्लैष्मिक संपर्क खून बह रहा है, सभी खून से दूषित नमूनों के आधे के साथ । लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि अस्थमा के रोगियों४३में परिधीय एयरवेज से इस बीएमएस प्रणाली का उपयोग कर MLF का नमूना लेना व्यवहार्य नहीं था ।
एक विकल्प के रूप में, हम विकसित किया है बीए एक नरम सैम कि लोअर एयरवेज के bronchoscopic जांच के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है का उपयोग, राइनोवायरस के साथ दमा विषयों की प्रयोगात्मक संक्रमण निम्नलिखित सहित6. बीए डिवाइस के होते हैं: एक बाहरी खोखले कैथेटर, एक हाथ टुकड़ा है कि सक्रियण पर सैम बाहर निकालना, और एक केंद्रीय प्लास्टिक गाइड तार कि अपने अंत पर सैम है । एनए के लिए के रूप में, बीए किट साफ कमरे का उपयोग कर चिकित्सा ग्रेड सामग्री से निर्मित कर रहे है और धूल और एलर्जी से मुक्त हैं । साथ ही, डिवाइस CE चिह्नित हैं और गामा-विकिरणित प्रदान किए गए हैं । सैम पट्टी नरम, अवशोषण है, और नमूना संग्रह के लिए तेजी से बाती । इसमें भी कम प्रोटीन बाध्यकारी है जो अवशोषित स्रावों के कुशल रेफरेंस की अनुमति देते हैं । डिवाइस एक bronchoscope के वर्किंग चैनल के माध्यम से फिट कर सकते हैं और airway के भीतर ब्याज की विशिष्ट साइटों पर तेजी से और सही नमूना MLF के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाल या बीएमएस के विपरीत, बीए संपर्क रक्तस्राव या अतिरिक्त रोगी असुविधा के बाद प्रक्रिया में परिणाम नहीं है ।
एनए और बीए के नमूनों की प्रोसेसिंग के लिए सावधान विचार दिया जाना चाहिए । नमूने सीधे जमे हुए और बैचों में संसाधित किया जा सकता है, या तुरंत संसाधित किया जा सकता है । प्रसंस्करण के प्रकार साइटोकिंस, chemokines और इम्युनोग्लोबुलिन, या वायरल, बैक्टीरियल, और मेजबान सेल एसोसिएटेड आरएनए के elutions के लिए immunoassays सहित कुछ बहाव अनुप्रयोगों, की ओर सिलवाया जा सकता है. हम नैदानिक संग्रह और प्रयोगशाला प्रसंस्करण नैदानिक शोधकर्ताओं के लिए एक गाइड के रूप में एनए और बीए के साथ जुड़े तकनीक प्रस्तुत करते हैं ।
मौजूदा airway नमूना तकनीकों से परिणाम उच्च चर के रूप में माना जाता है; वैकल्पिक नमूना तकनीक के लिए इस क्षेत्र में अनुसंधान का मानकीकरण की जरूरत है5। एनए और बीए एक गैर इनवेसिव तरीके से MLF के नमूने की अनुमति है, और रोमांचक करने के लिए स्वस्थ और रोगग्रस्त एयरवेज में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मापने की क्षमता है । इन तकनीकों मौजूदा तकनीक पर कई संभावित लाभ की पेशकश, अधिक से अधिक सहनशीलता, नमूना की गति सहित, अक्सर नमूना दोहराने की क्षमता, कम अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता, और प्रतिरक्षा मध्यस्थों की कमी हुई5 . अवशोषण की अवधि और प्रसंस्करण तकनीक का इस्तेमाल किया प्रत्येक अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और कड़ाई से नमूना घटनाओं के बीच बनाए रखा । इसके अतिरिक्त, बीए के मामले में, airway के भीतर नमूने की साइट सावधानी से व्यक्तियों के बीच दोहराया जाना चाहिए ।
ना, और विशेष रूप से बीए, नैदानिक अनुसंधान के लिए अभी भी अपेक्षाकृत उपंयास तकनीक हैं । हालांकि, इन तकनीकों का लाभ कई अध्ययनों में उनके उपयोग में हुई है, वैकल्पिक तकनीक के खिलाफ सावधान सत्यापन5सहित । इन उपकरणों अब CE-चिह्नित श्वसन अनुसंधान में व्यापक उपयोग के लिए तैयार उपकरणों के रूप में उपलब्ध हैं । जबकि एनए और अधिक वैकल्पिक नमूना तकनीक से छोटे नमूना मात्रा में बीए परिणाम, उच्च प्राप्त सांद्रता कम बहुतायत प्रतिरक्षा मध्यस्थों के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता में परिणाम कर सकते हैं ।
वांछित बहाव अनुप्रयोगों पर निर्भर करता है, ना और बीए के नमूनों को सीधे बाद में प्रसंस्करण के लिए जम सकता है, एक नैदानिक अनुसंधान वातावरण में अध्ययन व्यवहार्यता को बढ़ाने. नमूना हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल भी विशेष बहाव अनुप्रयोगों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है । सुझाया प्रसंस्करण तकनीक प्रोटीन या लिपिड प्रतिरक्षा मध्यस्थों या न्यूक्लिक एसिड के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, MLF अलग बफ़र्स के साथ eluted किया जा सकता है । सबसे पहले, immunoassay बफर श्लैष्मिक साइटोकिंस, chemokines, और एंटीबॉडी6,४५मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उच्च डिटर्जेंट के स्तर के साथ बफ़र्स भी सेल lysis होता है गारंटी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इंट्रा सेलुलर साइटोकिंस के शामिल किए जाने की अनुमति । Chaotropic आरएनए निष्कर्षण बफ़र्स वायरल संक्रमण, वायरल लोड, मेजबान mRNA, और microbiome के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, कार्बनिक सॉल्वैंट्स lipidomics और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अंत में, श्लैष्मिक सतहों से MLF के प्रत्यक्ष अवशोषण श्वसन, गैस्ट्रो आंत्र, मूत्रजननांगी, और अन्य श्लैष्मिक रोगों में संभावित उपयोग के साथ एक रोमांचक तकनीक है । हालांकि, इन होनहार अवशोषण तकनीक नमूने और व्यक्तिगत परख के लिए प्रसंस्करण तकनीक के सटीक सत्यापन की आवश्यकता होगी (एक रोग सेटिंग में मार्क्स) । इसके अलावा, इन उपंयास परिशुद्धता श्लैष्मिक नमूना तकनीक ऐसे रक्त, सांस से, और थूक के रूप में पारंपरिक नमूनों, के खिलाफ सत्यापन की आवश्यकता होगी । इन तकनीकों के साथ, MLF रोगाणुओं, साइटोकिंस, chemokines, prostanoids, और एंटीबॉडी को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
धन: यह काम इंपीरियल नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च (NIHR) बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर (BRC), NIHR हेल्थ प्रोटेक्शन रिसर्च यूनिट (HPRU) की भागीदारी में इंपीरियल कॉलेज लंदन में श्वसन संक्रमण में से धन द्वारा समर्थित किया गया पब्लिक हेल्थ इंग्लैंड (PHE) और NIHR इंपीरियल मरीज सेफ्टी ट्रांसलेशनल रिसर्च सेंटर के साथ । व्यक्त विचार लेखकों के है और जरूरी नहीं कि एन एच एस, NIHR, स्वास्थ्य विभाग या सार्वजनिक स्वास्थ्य इंग्लैंड के उन लोगों के हैं ।
Nasosorption (adult, 7mm width) | Hunt Developments | NSFL-FXI-11 | Different sizes are available for different patient groups/ages. |
Bronchosorption | Hunt Developments | BSFL-FXI-11 | Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm |
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) | Sigma Aldrich | CLS9301-1000EA | |
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) | Sigma Aldrich | CLS8160-24EA | For sterilisation of samples with infection risk. |
Assay (elution) buffer | Millipore | AB-33k | Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA. |
NP-40 Cell lysis buffer | Life Technologies | FNN0021 | Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels. |
Buffer RLT (RNA extraction) | Qiagen | 79216 | Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples. |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031-100ML-M | For elution of samples to be used in HPLC applications |
2.0ml micro-centrifuge tubes | Costar | 3213 | 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these. |