En protokol til den strukturelle analyse af polysaccharider af gelelektroforese (tempo), ved hjælp af mannan som et eksempel, er beskrevet.
Plant cell wall polysaccharider er notorisk vanskeligt at analysere, og de fleste metoder kræver dyrt udstyr, operatorer og store mængder af oprenset materiale. Her, vi beskriver en simpel metode til at få detaljerede polysaccharid strukturelle oplysninger, herunder opløsning af strukturelle isomerer. For polysaccharid analyse af gelelektroforese (tempo) hydrolyseret plant cell wall materialet med glycosyl hydrolaser specifikke polysaccharid af interesse (f.eks. mannanases for mannan). Storformat polyacrylamidgeler bruges derefter til at adskille de frigivne oligosaccharider, som er blevet fluorescently stemplet. Gels kan visualiseres med en modificeret gel imaging system (Se Tabel af materialer). Den resulterende oligosaccharid fingeraftryk kan enten være sammenlignet kvalitativt eller med replikering, kvantitativt. Kobling og forgrening oplysninger kan oprettes ved hjælp af yderligere glycosyl hydrolaser (f.eks. mannosidases og galactosidases). Mens denne protokol beskriver en metode til at analysere glucomannan struktur, kan det anvendes på enhver polysaccharid, som karakteriserede glycosyl hydrolaser findes. Alternativt, kan det bruges til at karakterisere romanen glycosyl hydrolaser bruger definerede polysaccharid substrater.
Polysaccharid analyse af gelelektroforese (tempo) er en metode for den detaljerede karakterisering af polysaccharider1,2,3. Plant cell wall polysaccharider er notorisk vanskeligt at analysere, og de fleste metoder kræver dyrt udstyr, operatorer og store mængder af oprenset materiale. Her, vi beskriver en simpel metode til at få detaljerede polysaccharid strukturelle oplysninger, herunder opløsning af strukturelle isomerer.
Forståelse plante cellevæg polysaccharid struktur er nødvendig for disse forskere at udforske plante cellevæg biosyntesen eller rollen som plante cellens væg i plante udvikling. For nylig, dog, plant cell wall sammensætning er blevet interessant til en bredere gruppe af forskere på grund af fokus på bruger plantebiomasse (hovedsagelig cellevæg) som en råvare til fremstilling af biobrændstoffer og biokemikalier4. Som et eksempel kræver effektivt enzymatisk stivelsen af dette materiale en detaljeret forståelse af polysaccharid strukturer, så optimeret enzymatisk cocktails kan være valgt5.
TEMPO har flere fordele sammenlignet med alternative metoder, som gør den ideel til hurtig analyse af komplekse glycan strukturer. For det første, det kræver ikke rensning af den pågældende, som er nødvendig for løsningen stat Kernemagnetisk resonans (NMR)6polysaccharid. For det andet tempo kan løse strukturelle isomerer, i modsætning til massespektrometri (MS, fx matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI) og electrospray Ionisation (ESI)), som også kan være en udfordring for at udføre ved væskekromatografi (LC) 7. for det tredje, tempoet er meget følsomme, med lav-picomole opløsning, i modsætning til tyndtlagskromatografi (TLC) eller papir kromatografi. Endelig, det ikke kræver dyrt udstyr eller specialist viden, som det er tilfældet for MS, NMR og LC.
TEMPO-metoden er baseret på specificitet af glycosyl hydrolase (GH) enzymer, der er målrettet mod visse glycosidic forbindelser i en blanding af polysaccharider. Når GH enzym agerer på polysaccharid kæden, afslører det en reducerende ende, hvilket kan derefter være kemisk derivatized, i dette tilfælde med en fluorescerende etiket. Den unhydrolyzed del af prøven er derfor gengives målbart af denne metode. Mærket oligosaccharider adskilles derefter i et stort format acrylamid gel ved elektroforese. Dette giver fremragende opløsning af meget lignende molekyler, for eksempel, trisaccharider Glc-mand-mand og Glc-mand-Glc vil have en anden Rasmussenf.
TEMPO er blevet brugt flittigt til at karakterisere forskellige xylan strukturer på tværs af plante arter8, for at identificere glycosyltransferase mutanter i Arabidopsis6,9,10,11 , til at udføre glycosyltransferase assays9, og at karakterisere romanen GH aktiviteter12,13. Vi har også for nylig brugt det til at karakterisere gær cellevæg mannan (Mahboubi og Mortimer, under forberedelse). Her beskriver vi en metode for kendetegner plant cell wall glucomannan struktur, baseret på tidligere rapporter11,14.
TEMPO er en enkel metode til kendetegner polysaccharid struktur. Det kan anvendes til enhver polysaccharid, hvortil der er kendte GHs med karakteriseret aktivitet, se talrige eksempler i litteratur1,6,9,11. TT er også blevet anvendt til karakterisering af roman GHs12,13,18 og glycosyltransferases9, ved at gøre brug af definerede polysaccharid substrater og acceptorer.
Reproducerbar, fortolkelige resultater er afhængige af tre vigtige trin. Først, GHs brugt bør være fri for forurenende aktiviteter. Dette er bedst opnås ved kun at bruge heterologously udtrykt, affinitet renset enzymer. For det andet, for de fleste eksperimenter, det er vigtigt at enzymatisk hydrolyse af substraterne er ved afslutning. Dette vil sikre, at den samme biomasse hydrolyseret med samme GH giver den samme fingeraftryk i hvert eksperiment. Endelig bør der være et overskud af fluorophore i forædling reaktion. Dette sikrer, at de tilgængelige reducerende ender mærkes på næsten 100%. Dette vil resultere i høj reproducerbarhed af resultaterne samt kvantitative data.
Gel og reagens kvalitet er afgørende for at sikre reproducerbare data. Dårlig kvalitet buffere, især af forkert pH, luft bobler i gelen, og prøver med en overskydende salt kan alle påvirke beslutningen og fastholdelse faktor af oligosaccharider. Medtagelsen af de anbefalede kontrol beskrevet i afsnittet protokol og resultater vil imidlertid aktivere fejlfinding.
TEMPOET er begrænset af sin evne til at identificere oligosaccharider. For nogle forsøg er et simpelt fingeraftryk alt, hvad der er nødvendigt. Dog for at virkelig kvantificere mængden af glucomannan i et udsnit af luft, for eksempel, identiteten på alle de frigivne oligosaccharider er påkrævet, hvilket er en tidskrævende proces. Dette er mere ligetil for mindre komplekse polysaccharider såsom xylan3. Da der er få oligosaccharid standarder kommercielt tilgængelige, kan det ikke altid være muligt eller ønskeligt at identificere alle bandene. I dette tilfælde kan tempo give meget gratis data til massespektrometri (dvs. MALDI-CID9 eller ESI-MS7, og NMR6). For disse metoder er det ofte nyttigt at gøre en omfattende forberedelse, adskilt af størrelse-udelukkelse kromatografi og derefter analysere hver fraktion af både tempo før MS eller NMR. Mens det er blevet rapporteret at bands kan være skåret ud og identificeret ved MALDI-CID, i praksis har vi fundet, at dette har en lav grad af succes (muligvis på grund af vekselvirkninger mellem de mærket oligosaccharider acrylamid gel når den udsættes for UV-lys).
Andre store begrænsning af tempo er overførselshastighed. Hvis du vil have god kvalitet, fortolkelige geler med de passende kontrol, hver gel har kun ~ 10 eksperimentelle prøver og en forsker kan forvente at køre ~ 4 tempo geler pr. dag. En version af tempo ved hjælp af kapillær elektroforese (CE) har for nylig været udviklede19, som giver mulighed for forberedelse af prøver i 96-brønd plader. Det har været anvendt med succes til at karakterisere glycosyltransferase enzym aktiviteter og polysaccharid strukturer6,19, selv om det kræver adgang til en CE-maskine, som kan være dyrt at købe og vedligeholde.
The authors have nothing to disclose.
TEMPO-metoden blev udviklet og optimeret af forskellige medlemmer af gruppen Dupree (University of Cambridge, England) i år, og vi værdsætter alle deres bidrag. Dette arbejde blev finansieret som en del af DOE fælles BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) understøttes af U. S. Department of Energy, Office of Science, Office af biologiske og miljømæssige forskning, gennem kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellem Lawrence Berkeley National Laboratory og U. S. Department of Energy. Vi takker også Thea Pick og Vy Ngo for hjælp med csla9 prøver.
Oligosaccaharide Standards | |||
Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other specialty chemicals | |||
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
2-picoline borane | TCI | B3018 | |
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Specialty Equipment | |||
Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18×24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
Glycosyl hydrolases | |||
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab supplies | |||
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |