जेल ट्रो (गति) द्वारा polysaccharides के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल, एक उदाहरण के रूप में mannan का उपयोग करते हुए वर्णित है ।
संयंत्र सेल दीवार polysaccharides बेहद मुश्किल का विश्लेषण कर रहे हैं, और सबसे तरीकों महंगा उपकरण, कुशल ऑपरेटरों, और शुद्ध सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यहां, हम विस्तृत polysaccharide संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन, संरचनात्मक isomers के संकल्प सहित । जेल ट्रो (गति) द्वारा polysaccharide विश्लेषण के लिए, संयंत्र सेल दीवार सामग्री ब्याज की hydrolases के लिए विशिष्ट glycosyl polysaccharide के साथ hydrolyzed है (जैसे, mannanases के mannan के लिए) । बड़े प्रारूप polyacrylamide जैल तो जारी oligosaccharides, जो फ्लोरोसेंट लेबल किया गया है अलग किया जाता है । जैल एक संशोधित जेल इमेजिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ visualized किया जा सकता है । परिणामी oligosaccharide फ़िंगरप्रिंट या तो गुणात्मक की तुलना की जा सकती है या, प्रतिकृति के साथ, मात्रात्मक रूप से । अतिरिक्त glycosyl hydrolases (उदा., mannosidases और galactosidases) का उपयोग करके लिंकेज और बंटी जानकारी स्थापित की जा सकती है । Whilst इस प्रोटोकॉल glucomannan संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन, यह किसी भी polysaccharide के लिए लागू किया जा सकता है जो glycosyl hydrolases मौजूद विशेषता । वैकल्पिक रूप से, यह उपंयास glycosyl hydrolases परिभाषित polysaccharide सब्सट्रेट का उपयोग कर विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है ।
जेल ट्रो द्वारा Polysaccharide विश्लेषण (गति) polysaccharides1,2,3के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए एक विधि है । संयंत्र सेल दीवार polysaccharides बेहद मुश्किल का विश्लेषण कर रहे हैं, और सबसे तरीकों महंगा उपकरण, कुशल ऑपरेटरों, और शुद्ध सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यहां, हम विस्तृत polysaccharide संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन, संरचनात्मक isomers के संकल्प सहित ।
संयंत्र सेल दीवार polysaccharide संरचना को समझना उन शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है संयंत्र सेल दीवार के संश्लेषण या संयंत्र के विकास में संयंत्र सेल दीवार की भूमिका की खोज । हाल ही में, तथापि, संयंत्र सेल दीवार संरचना के कारण शोधकर्ताओं का एक व्यापक समूह के लिए दिलचस्प हो गया है संयंत्र बायोमास (अनिवार्य रूप से सेल की दीवार) का उपयोग कर एक टाक के रूप में जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए4। एक उदाहरण के रूप में, इस सामग्री के कुशल एंजाइमी शर्करीकरण polysaccharide संरचनाओं की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता है, ताकि अनुकूलित एंजाइमी कॉकटेल5का चयन किया जा सकता है ।
गति वैकल्पिक तरीकों जो यह जटिल glycan संरचनाओं के तेजी से विश्लेषण के लिए आदर्श बनाने पर कई फायदे हैं । सबसे पहले, यह प्रश्न में polysaccharide की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है, के रूप में समाधान राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर)6के लिए आवश्यक है । दूसरे, गति संरचनात्मक isomers को हल कर सकते हैं, जन स्पेक्ट्रोमेट्री के विपरीत (MS, उदा., मैट्रिक्स की सहायता से लेजर desorption/ionization (मालदी) और electrospray ionization (ईएसआई)), जो भी तरल क्रोमैटोग्राफी (LC) द्वारा प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है 7. तीसरा, गति बहुत संवेदनशील है, कम picomole संकल्प के साथ, पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) या कागज क्रोमैटोग्राफी के विपरीत । अंत में, यह महंगी उपकरण या विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता नहीं है, के रूप में एमएस, एनएमआर, और नियंत्रण रेखा के लिए मामला है ।
गति विधि glycosyl hydrolase (GH) एंजाइमों, जो polysaccharides के एक मिश्रण में कुछ glycosidic संपर्क लक्ष्य की विशिष्टता पर निर्भर करता है । जब GH एंजाइम polysaccharide श्रृंखला पर कार्य करता है, यह एक को कम करने अंत जो तो रासायनिक derivatized हो सकता है पता चलता है, एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ इस मामले में. नमूना का unhydrolyzed भाग इसलिए इस विधि द्वारा undetectable रेंडर किया जाता है । लेबल oligosaccharides तो ट्रो द्वारा एक बड़े प्रारूप acrylamide जेल में अलग कर रहे हैं । यह बहुत ही अणुओं के उत्कृष्ट संकल्प देता है, उदाहरण के लिए, trisaccharides Glc-man-man और Glc-man-Glc एक अलग आरएफहोगा ।
गति बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है के लिए संयंत्र प्रजातियों में विभिंन xylan संरचनाओं8विशेषताएं, Arabidopsis6,9,10,11 में glycosyltransferase म्यूटेंट की पहचान के लिए , glycosyltransferase परख9प्रदर्शन करने के लिए, और उपंयास GH गतिविधियों12,13की विशेषता है । हम भी हाल ही में इस्तेमाल किया है यह खमीर सेल दीवार mannan (Mahboubi और मोर्टिमर, तैयारी में) की विशेषताएं । यहां हम निस्र्पक संयंत्र सेल दीवार glucomannan संरचना के लिए एक विधि का वर्णन, पिछले रिपोर्ट11,14के आधार पर ।
1. संयंत्र सामग्री की कटाई फसल ताजा संयंत्र सामग्री (~ 20 मिलीग्राम) और तुरंत यह ९६% में (v/v) इथेनॉल और गर्मी में डूब ७० & #176; C 30 मिनट के लिए; यह किसी भी कोशिका दीवार अपमानजनक एंजाइमों मौजूद निष्क्रिय करता है । शुष्क सामग्री के लिए, चरण 2. पर प्रारंभ करें सावधानी: इथेनॉल ज्वलनशील है. नोट: एक एकल स्टेम या rosette पत्ती विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करेगा । हालांकि, अगर ऊतक की एक बड़ी राशि और परित के बाद से यह बाहर वजन और संभाल करने के लिए आसान है विश्लेषण है कम त्रुटियाँ उत्पन्न होती हैं । ध्यान से रिकॉर्ड ऊतक प्रकार और विकासात्मक चरण, के रूप में polysaccharide संरचना दोनों के साथ बदलता है । उदाहरण के लिए, Arabidopsis थालियाना (यहां इस्तेमाल किया) के साथ, बोयेस एट अल से तरीकों के अनुसार ऊतक चरण १५ नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम फूलना स्टेम के निचले आधे का उपयोग किया है, जहां पहली silique पूरी तरह से लम्बा है लेकिन नहीं तेजाब.
2. शराब अघुलनशील अवशेषों की तैयारी (air) हवा तैयार, मोर्टिमर एट अल की विधि का पालन. 9 या ऐसी ही एक अन्य विधि, जिसमें सुक्रोज और स्टार्च जैसे घुलनशील शर्करा की कमी पाउडर का उत्पादन करने के लिए ।
3. वायु के Aliquoting और पूर्व उपचार
नोट: प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक हवा की सटीक मात्रा (a) सामग्री में रुचि के polysaccharide की बहुतायत पर निर्भर करेगा और (b) द्वारा जारी oligosaccharides का औसत आकार GH. विधि प्रत्येक oligosaccharide के अंत को कम करने के लिए एक फ्लोरोसेंट अणु कहते हैं, तो oligosaccharides की संख्या प्रयोग की संवेदनशीलता को निर्धारित करता है । एक दिशानिर्देश के रूप में, Arabidopsis स्टेम में glucomannan के लिए GH5 के साथ पच/GH26 (वर्णित के रूप में), ५०० & #181; छ सिफारिश की है 11 , जबकि xylan के लिए Arabidopsis तना पच में GH11 के साथ, १०० & #181; g की सिफारिश की है के रूप में मोर्टिमर & #39; s अि ३ . एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में वजन हवा (10-15 मिलीग्राम), और 2 मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एच 2 ओ जोड़ें । एक भी निलंबन को प्राप्त करने के भंवर । यदि यह समस्या है, तो इस प्रक्रिया में मदद करने के लिए एक ग्लास homogenizer का उपयोग करें । Aliquot ५०० & #181; छ microfuge ट्यूबों में । सूखी aliquots एक निर्वात केंद्रापसारक का उपयोग (सामग्री के तालिका देखें) रातोंरात 30 & #176; ग. प्री-इलाज हवा 1 मीटर NaOH (20 & #181; L) के लिए 1 ज के कमरे के तापमान पर; इस de-acetylates polysaccharides और फूल फाइबर microfibrils, बायोमास संरचना में खलल न डालें और GH का उपयोग की अनुमति । नोट: यह चरण शुद्ध polysaccharides के लिए छोड़ा जा सकता है । सावधानी & #8211; मजबूत अम्ल/ शामिल है एक no-एंजाइम वायु नियंत्रण के लिए एक aliquot (सभी नमूनों के रूप में एक ही इलाज, ४.१ कदम के अलावा. शामिल है) । Add २०० & #181; l के H 2 O र 20 & #181; l 1 M HCl को बेअसर. परीक्षण कि पीएच 1 & #181 को हटाकर ~ 6-7 है; L और यह कागज पीएच संकेतक स्ट्रिप्स पर खोलना. Add ५० & #181; एल 1 एम अमोनियम एसीटेट बफर, पीएच ६.० (या जो भी पीएच अध्ययन में प्रयुक्त GHs के लिए उपयुक्त है) और एच 2 O ५०० & #181 की कुल मात्रा देने के लिए; l नोट: अमोनियम एसीटेट के बाद से यह सुखाने पर उदात्त प्रयोग किया जाता है, और इसलिए यह नमूना के लिए अतिरिक्त नमक नहीं जोड़ता है । नमक की एक अतिरिक्त गरीब बैंड आकार और गति जेल पर संकल्प करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
4. Glycosyl Hydrolases (GHs) के साथ हवा का Hydrolysis
नोट: चर्चा में उल्लेखित है कि, GHs की पवित्रता महत्वपूर्ण है । केवल उपयोग heterologously व्यक्त की, अपनत्व शुद्ध एंजाइमों । निर्माता से हर बहुत की प्राप्ति पर, hydrolyze निर्धारित aliquots सब्सट्रेट ( उदा., ५०० & #181; g AIR) GH की बढ़ती मात्रा के साथ रातोंरात ( उदा, ०.५, 1, 2, 5, 10, 15, 20 & #181; l) (3 इकाइयां/& #181; l). जब GH की एक अतिरिक्त है, गति फिंगरप्रिंट समान दिखेगा । एंजाइम की एक अतिरिक्त एक प्रतिलिपि परिणाम देने के लिए आवश्यक है क्योंकि यह निश्चित होना चाहिए कि hydrolysis प्रतिक्रिया समापन बिंदु आ रहा है । एक पूर्व निर्धारित मात्रा (ऊपर देखें) के mannanases (GH5 और GH26 11 ) के लिए एयर aliquots से बफर स्टेप ३.५ में जोड़ें, के रूप में अच्छी तरह से एक सकारात्मक नियंत्रण (30 & #181 konjac glucomannan के जी), और एक नहीं हवा नकारात्मक नियंत्रण (एक में एंजाइम मिश्रण खाली ट्यूब) । भंवर, और फिर संक्षेप में स्पिन ट्यूब के तल में प्रतिक्रिया मिश्रण इकट्ठा करने के लिए । रात भर में ३७ & #176; सी (या पसंद की GH के लिए उपयुक्त तापमान) कोमल आंदोलन (~ १०० rpm) के साथ । ९५ पर मशीन द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो & #176; ग के लिए 20 min. नोट: कैप क्लोजर फ्लिप टॉप microfuge ट्यूबों को सील करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से एक बेंच शीर्ष microfuge का उपयोग कर केंद्रापसारक, और supernatant. बनाए रखने reसस्पैंड गोली में २५० & #181; L ज 2 हे, के रूप में ऊपर के केंद्रापसारक, और बनाए रखने supernatant. दोनों supernatants गठबंधन, और एक निर्वात केंद्रापसारक में सूखी (सामग्री के तालिका देखें) 30 & #176; C (~ 3 h या रात भर हीटिंग के बिना).
5. Oligosaccharide मानकों की तैयारी 1 mM स्टॉक सॉल्यूशंस तैयार करने में ज 2 ओ ऑफ mannose (मैन), mannobiose (मैन 2 ), mannotriose (मैन 3 ), mannotetraose (मैन 4 ), mannopentaose (मैन 5 ) और mannohexaose (Man 6 ), all & #946;, 1-4 linked. Aliquot और दुकान पर-20 & #176; ग जब तक अपे. 1 & #181 के संयोजन से एक आदमी 1-6 मिश्रण के 3 अलग सांद्रता तैयार करें; l (मानक s), 2 & #181; l (S2) या 5 & #181; l (S3) के सभी छह. एक निर्वात केंद्रापसारक में सूखी (देखें सामग्री की टेबल ) पर 30 & #176; ग (~ 1 ज).
6. Derivitization ऑफ Oligosaccharides ज Aminonaphthalene 2 trisulfonic एसिड 17:3 में ०.२ एम चींटियों (8–1, 3, 6-O:acetic एसिड) के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करते हैं । गर्म स्टॉक को ६० & #176; ग पूरी तरह से ठोस भंग करने के लिए. स्टोर at-20 & #176; C, प्रकाश से रक्षित, 2-3 माह के लिए । DMSO में 2-picoline borane (2-पंजाब) के एक ०.२ मीटर शेयर समाधान तैयार करते हैं । यह अत्यंत hygroscopic है, इसलिए तुरंत DMSO में रसीद पर सभी पाउडर को फिर से सस्पेंड कर दें । Aliquot, और दुकान पर-20 & #176; ग के लिए 1-2 साल । गल aliquots यथा आवश्यक (स्टोर 4 & #176; C 2 सप्ताह के लिए, और तब छोड़ें) । के derivatization बफर तैयार कर H 2 O:acetic अम्ल: DMSO पर 17:3:20. प्रत्येक नमूने के लिए, जोड़ें 5 & #181, चींटियों का l 5 & #181; l का 2-पंजाब और 10 & #181; l का derivatization बफर. संक्षेप में ट्यूब के नीचे में इकट्ठा करने के लिए स्पिन, अच्छी तरह से भंवर, और फिर संक्षेप में फिर से स्पिन । See चित्रा १ प्रतिक्रिया वर्णन. में रात भर के नमूने ३७ & #176; ग, प्रकाश से रक्षित. एक निर्वात केंद्रापसारक में सूखी (देखें सामग्री की टेबल ) पर 30 & #176; ग (~ 2 ज). reसस्पैंड नमूनों और मानक में १०० & #181; L 3 मीटर यूरिया. संग्रह पर-20 & #176; C, आवश्यक होने तक प्रकाश से रक्षित.
7. पेस की तैयारी जैल
नोट: जेल कास्टिंग उपकरण के विधानसभा ब्रांड पर निर्भर करेगा । यहां, हम uएसई एक ऊर्ध्वाधर ट्रो प्रणाली (सामग्री के टेबल देखें), 18 सेमी x 24 सेमी ग्लास प्लेटों और १.५ mm स्पेसिंग से सुसज्जित । इकट्ठा जेल कास्टिंग उपकरण प्रति निर्माता & #39; s निद. 10x गति बफर (1m Tris-बोराटे, पीएच ८.२) बनाने के रूप में इस प्रकार है: Tris के १२१.१४ जी-आधार को ~ ४०० एमएल के एच 2 ओ, और मिश्रण को भंग करने के लिए जोड़ें । ठोस बोरिक एसिड (लगभग ६० ग्राम) के अलावा द्वारा ८.२ के लिए पीएच समायोजित करें, और फिर 1 एल करने के लिए मात्रा बनाने एक 10% (w/v) अमोनियम persulfate (एपीएस) स्टॉक में ज 2 ओ. Aliquot और स्टोर पर-20 & #176; ग. गल aliquots एक बार, 4 & #176 पर स्टोर; c और 2 सप्ताह के बाद छोड़ें. बनाओ और संपति जेल डालो । उपरोक्त उपकरणों के लिए, 1 जेल ५० मिलीलीटर के समान । एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में, मिश्रण एच 2 ओ (२०.२ मिलीलीटर), 5 मिलीलीटर 10x गति बफर, २४.६ मिलीलीटर ४०% acrylamide/बीआईएस-acrylamide (29:1 acrylamide: बीआईएस) । (सावधानी: विषाक्त). Add २०० & #181; अनुप का l व 20 & #181; l का n, n, n, n & #180;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). धीरे मिश्रण करने के लिए पलटना (हवा बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए) । एक सीरम या अंय बड़ी मात्रा पिपेट का उपयोग कर जेल डालो, ~ गिलास प्लेटों के ऊपर से नीचे 4 सेमी । जेल में फंस रही हवाई बुलबुले की संभावना के लिए ध्यान देना । अगर वे करते हैं, बहना बंद करो, और झुकाव/जेल उंहें रिहा करने के लिए नल ओवरले के साथ जेल isopropanol (सावधानी : ज्वलनशील) या, ध्यान से, एच 2 के साथ ओ. polymerize को जेल (20-30 मिनट) की अनुमति दें, तो शीर्ष परत बंद डालो । अगर isopropanol इस्तेमाल किया गया था, तो एच 2 के साथ 2x धो सोख्ता कागज का उपयोग कर किसी भी अतिरिक्त तरल सूखी । बनाने और स्टैकिंग जेल डालना । मिक्स ६.८ एमएल एच 2 ओ, 1 एमएल 10x पेस बफर, २.८ एमएल acrylamide/बीआईएस-acrylamide ( सावधानी: विषाक्त), ८० & #181; एल ए पी एस, और 8 & #181; एल के TEMED में एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । मिश्रण करने के लिए पलटना, और बहुलक समाधान जेल के शीर्ष पर ओवरले । कंघी दांत के नीचे हवा के बुलबुले फँसाने से परहेज polymerize करने के लिए जेल की अनुमति दें (20-30 मिनट), नम ऊतक में लपेट और फिर प्लास्टिक की चादर में, और 4 पर स्टोर & #176; C जब तक आवश्यक है । जगह में कंघी के साथ स्टोर । नोट: पेस जैल 2 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए संग्रहीत किया जा सकता है (हालांकि कम 1 सप्ताह आदर्श है), अगर वे नम रखा जाता है ।
8. चल रहा है एक गति जेल एक स्थाई मार्कर का उपयोग करने के लिए कांच पर अच्छी तरह से पदों लेबल, जो लोडिंग आदेश का ट्रैक रखने में मदद करेगा, और पहचान जहां कुओं एक बार कंघी हटा दिया जाता है । कंघी को निकाल । 1x गति बफर के साथ कुओं भरें । उपयोग क 10 & #181; l microsyringe को भार 2 & #181; क l मानकों और नमूनों का कुओं में बाहरी गलियों के उपयोग से बचें, जो नमूने खराब चल जाते हैं । जेल-चल तंत्र के ऊपरी चैंबर इकट्ठा, और एक ठंडा (~ 10 & #176 में जेल जगह) चल टैंक (10 & #176; सी) 1x गति बफर युक्त । 1x गति बफर के साथ ऊपरी चैंबर भरें. पावर चालू करें, और 30 मिनट के लिए २०० v (निरंतर v) पर जेल चलाने, और फिर वृद्धि वोल्टेज के लिए १००० v 1 h ४० मिनट के लिए । जैल को हल् के से बचाएं ( जैसे, को काले कचरे के थैले में लपेटकर टैंकर) । नोट: जैल पर जांच करें ~ 5 मिनट पर वोल्टेज मोड़ के बाद, और फिर एक और 5 मिनट के लिए वोल्टेज में वृद्धि के बाद १,००० वी. यदि पावर पैक वोल्टेज बनाए रखने में असमर्थ है तो वहां एक बफर रिसाव की संभावना है । टैंक से जेल हटा दें । ऊपरी चैंबर पुनः, ध्यान से सभी गैसकेट के स्थान की जांच । कांच की थाली के ऊपरी छोर पर एक बड़ी चिप प्लेट गैसकेट के साथ एक अच्छी मुहर बनाने को रोकने सकता है । यह आमतौर पर अस्थाई रूप से 5% (डब्ल्यू/वी) पिघला हुआ agarose की एक बूंद जोड़ने के द्वारा हल किया जा सकता है गिलास के छिल हिस्सा, ऊपरी चैंबर जोड़ने से पहले ।
9. visualizing एक गति जेल
नोट: transilluminator में लंबी लहर यूवी बल्बों से सुसज्जित एक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करें, और fluorophore के लिए उपयुक्त है, जो कैमरे के लिए एक उत्सर्जन फिल्टर, यहाँ ५३० एनएम. वैकल्पिक रूप से, एक लेज़र स्कैनर का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसा कि Goubet 2 . सुनिश्चित जेल इमेजिंग प्रणाली यह नम एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ पोंछते द्वारा धूल मुक्त है । गति टैंक से जेल निकालें, और संक्षेप में देखने whilst जेल ग्लास प्लेटों में अभी भी है (& #60; ८० ms) निर्धारित करने के लिए अगर डाई सामने अभी भी जेल पर है । एक कील उपकरण का उपयोग कर जेल खुला है, और whilst जेल अभी भी एक गिलास प्लेट पर है, दोनों स्टैकिंग जेल को दूर करने के लिए एक पिज्जा कटर का उपयोग करें और, अगर डाई मोर्चा जेल पर अभी भी है, जेल के नीचे. डाल ~ 5 एमएल एच 2 transilluminator की सतह पर, और फिर सीधे transilluminator पर जेल हस्तांतरण । ६०५ यूवी के लिए फिल्टर सेट, और longwave यूवी transilluminator पर बारी (सामग्री के तालिका देखें) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. नोट: चींटियों fluorophore यहां इस्तेमाल किया एक उत्तेजना/353/520 एनएम के उत्सर्जन है । विभिंन जोखिम समय पर कई छवियां ले ( उदा, १०० ms 10 एस के लिए) । यूवी प्रकाश बटन पर क्लिक करके छवियों के बीच बंद कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें (इसे बंद करने के लिए) प्रतिदीप्ति अपमानजनक से बचने के लिए । सुनिश्चित करें कि छवियों के कम से 2 कोई संतृप्त बैंड है (जेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर इस का संकेत होगा) । फ़ाइलों को high-resolution. tif images. के रूप में सहेजें नोट: छवियां जेल इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है, या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, जैसे ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करके । quantitation. की चर्चा के लिए परिणाम अनुभाग देखें
पेस निस्र्पक polysaccharide संरचना के लिए एक सीधी विधि है । यह किसी भी polysaccharide के लिए लागू किया जा सकता है जिसके लिए वहां विशेषता गतिविधि के साथ GHs ज्ञात कर रहे हैं, साहित्य में कई उदाहरण देखें1,6,9,11। टीटी भी उपंयास GHs12,13,18 और glycosyltransferases9के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया गया है, परिभाषित polysaccharide सब्सट्रेट और स्वीकार करने का उपयोग करके ।
प्रतिलिपि, व्याख्यात्मक परिणाम तीन महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर हैं । सबसे पहले, इस्तेमाल किया GHs प्रदूषित गतिविधियों से मुक्त किया जाना चाहिए । यह सबसे अच्छा केवल heterologously का उपयोग कर व्यक्त की, अपनत्व शुद्ध एंजाइमों द्वारा प्राप्त की है । दूसरा, ज्यादातर प्रयोगों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सब्सट्रेट्स के एंजाइमी hydrolysis पूरा होने पर है । यह सुनिश्चित करेगा कि एक ही GH के साथ एक ही बायोमास hydrolyzed हर प्रयोग में एक ही फिंगरप्रिंट देता है । अंत में, वहां derivatization प्रतिक्रिया में fluorophore की एक अतिरिक्त होना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि उपलब्ध कम करने समाप्त होता है पर लेबल १००% के करीब है । यह परिणाम की उच्च reproducibility, साथ ही मात्रात्मक है कि डेटा में परिणाम होगा ।
जेल और एजेंट गुणवत्ता प्रतिलिपि डेटा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । खराब गुणवत्ता बफ़र्स, विशेष रूप से गलत पीएच, जेल में हवा के बुलबुले, और नमक की एक अतिरिक्त के साथ नमूने सभी संकल्प और oligosaccharides के प्रतिधारण कारक को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल और परिणाम अनुभाग में वर्णित अनुशंसित नियंत्रणों को शामिल करने से समस्या निवारण सक्षम हो जाएगा ।
गति oligosaccharides की पहचान करने की क्षमता तक सीमित है । कुछ प्रयोगों के लिए, एक सरल फिंगरप्रिंट है कि सभी आवश्यक है । हालांकि, वास्तव में हवा के एक नमूने में glucomannan की मात्रा quantitate, उदाहरण के लिए, सभी जारी oligosaccharides की पहचान की आवश्यकता है, जो एक समय लेने वाली प्रक्रिया है । यह xylan3जैसे कम जटिल polysaccharides के लिए अधिक सरल है । के बाद से वहां कुछ oligosaccharide मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, यह हमेशा संभव नहीं हो सकता है या वांछनीय सभी बैंड की पहचान । इस मामले में, गति बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (यानी, मालदी-सीआईडी9 या ईएसआई-MS7, और एनएमआर6) के लिए बहुत मानार्थ डेटा प्रदान कर सकते हैं । इन विधियों के लिए, यह अक्सर एक बड़े पैमाने पर तैयारी करने के लिए उपयोगी है, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग है, और फिर दोनों गति से प्रत्येक अंश का विश्लेषण करने से पहले एमएस या एनएमआर । Whilst यह बताया गया है कि बैंड और उत्पाद की पहचान की जा सकती है मालदी-सीआईडी, व्यवहार में हमने पाया है कि इस सफलता की एक कम दर है (संभवतः acrylamide जेल के साथ लेबल oligosaccharides की बातचीत के कारण जब यूवी प्रकाश को उजागर) ।
गति के अंय प्रमुख सीमा प्रवाह है । उचित नियंत्रण के साथ अच्छी गुणवत्ता, व्याख्यात्मक जैल है, प्रत्येक जेल केवल ~ 10 प्रयोगात्मक नमूनों होगा, और एक शोधकर्ता प्रति दिन ~ 4 गति जैल चलाने के लिए उम्मीद कर सकते हैं । हाल ही में, केशिका ट्रो (CE) का उपयोग कर गति का एक संस्करण है, जो ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों की तैयारी की अनुमति देता है19विकसित किया गया है । यह सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है glycosyltransferase एंजाइम गतिविधियों और polysaccharide संरचनाओं की विशेषताएं6,19, हालांकि यह एक CE मशीन है, जो खरीद और बनाए रखने के लिए महंगा हो सकता है के लिए उपयोग की आवश्यकता है ।
The authors have nothing to disclose.
गति विधि Dupree समूह (कैंब्रिज विश्वविद्यालय, यूके) के विभिंन सदस्यों द्वारा वर्षों से विकसित और अनुकूलित किया गया था, और हम उनके सभी योगदान की सराहना करते हैं । यह काम डो संयुक्त जैव ऊर्जा संस्थान (http://www.jbei.org) के भाग के रूप में वित्त पोषित किया गया था अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान के कार्यालय, अनुबंध DE-AC02 के माध्यम से-05CH11231 के बीच लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला और ऊर्जा विभाग के यू. एस. हम भी थीा उठाओ और csla9 नमूने तैयार करने के साथ मदद के लिए Vy एनजीओ धंयवाद ।
Oligosaccaharide Standards | |||
Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other specialty chemicals | |||
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
2-picoline borane | TCI | B3018 | |
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Specialty Equipment | |||
Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18×24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
Glycosyl hydrolases | |||
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab supplies | |||
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |